利用转基因技术培育马铃薯（Solanum tuberosum L.）高淀粉及抗病新品系

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上重要的粮菜兼用型作物,在人们的日常生活和国民经济中起着举足轻重的作用。在目前马铃薯生产中,病虫害等问题严重限制了马铃薯产业的发展。同时,市场对马铃薯品质的要求也越来越高,加工型品种的匮乏给马铃薯育种工作提出了新的课题。由于马铃薯栽培种具有同源四倍体遗传分离复杂的特点,所以用常规育种的手段很难在较短时间内育成优良品种。利用转基因技术可以将有价值的基因转入现有的优良品种中,不改变现有品种本身所特有的优良性状,在较短的时间内获得有价值的育种新材料。本研究采用农杆菌介导的遗传转化技术主要开展两方面的研究工作:一是将淀粉合成过程中的关键酶基因glgC导入马铃薯栽培品种,获得转基因植株;二是将诱导非寄主过敏性反应的hrp基因导入马铃薯中,验证调控元件马铃薯损伤诱导型启动子Wun1和Me13’增强子在广谱抗病策略中的可行性,获得转基因植株并进行检测。在遗传转化过程中,首先对受体再生系统建立进行了研究。选用试管苗茎段、叶片作为外植体材料,以MS为基本培养基成分,对生长激素的浓度和配比进行优化组合,筛选出有利于受体材料的高效培养基配方。最终确定出有利于茎段和叶片愈伤诱导的培养基为:MS+6-BA2.5mg/L+2,4-D0.6mg/L,诱愈率可达100%;有利于芽分化的培养基为:MS+6-BA2.5mg/L+IAA0.25mg/L +2,4-D0.25mg/L,出芽率可达65.33%。随后通过外植体材料生长状态、Kan敏感性、预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间等对转化的影响研究,建立和优化了转化体系。总体来讲,在1/2 MS（大量元素减半）附加3%蔗糖的液体培养基上生长的材料的茎段为最佳外植体,通过Kan敏感性试验,确定了使用75 mg/L Kan作为转化茎段愈伤诱导过程适宜选择压力,在转化苗生根诱导培养中,使用50mg/L Kan进行选择比较适合。愈伤组织发生到出芽阶段的Kan25、50、75 mg/L的逐步增加浓度筛选及生根阶段的Kan25、50mg/L的筛选有效地减少了后期鉴定的工作量,获得了较高的转化率。茎段预培养2天,抗性愈伤诱导率达到48.24%;农杆菌浓度在OD600为0.5,侵染时间为8min时,抗性愈伤生长状态最好,抗性愈伤成功率最高（可达84.15%）;共培养时间以3d时转化效果较好,出愈率可达83.5%。在优化转化体系建立的前提下,以三个马铃薯四倍体栽培品种陇薯3号、甘农薯2号和台湾红皮试管苗茎段为受体材料,分别用块茎特异性表达启动子驱动的glgC基因

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 马铃薯遗传转化研究进展
• 1.1 马铃薯转化的再生系统及靶组织的选择
• 1.1.1 愈伤组织再生系统
• 1.1.2 直接分化再生系统
• 1.1.3 原生质体再生系统
• 1.2 马铃薯遗传转化的方法
• 1.2.1 农杆菌介导的遗传转化
• 1.2.1.1 农杆菌-植物间基因转移的分子基础
• 1.2.1.2 农杆菌介导基因转化的方法
• 1.2.1.3 马铃薯基因工程中农杆菌介导的遗传转化
• 1.2.2 基因枪法遗传转化
• 1.2.3 微束激光穿刺转化法
• 1.2.4 PEG 介导法
• 1.2.5 超声波介导法
• 1.3 转基因植物中的标记基因
• 1.3.1 植物遗传转化中常用的标记基因
• 1.3.2 标记基因的安全性问题
• 1.3.3 转基因作物中标记基因的消除
• 1.3.4 目标基因及其产物的安全性问题
• 1.3.5 外源基因在转基因后代中的整合、表达和遗传
• 1.3.5.1 外源基因在植物体内的整合
• 1.3.5.2 转基因植株的遗传行为
• 1.3.6 转基因沉默及对策
• 1.3.7 转基因植物的商业化生产
• 2 基因工程技术在马铃薯遗传改良上的应用
• 2.1 马铃薯淀粉基因工程
• 2.1.1 淀粉在食品及其它工业中的应用
• 2.1.2 淀粉的生物合成
• 2.1.3 ADPG 焦磷酸化酶基因研究与马铃薯高淀粉基因工程
• 2.1.3.1 AGPase 的功能
• 2.1.3.2 AGPase 的定位
• 2.1.3.3 AGPase 的酶学
• 2.1.3.4 AGPase 的分子生物学
• 2.1.3.5 基因工程提高淀粉含量
• 2.2 马铃薯抗病基因工程及广谱抗病策略的应用
• 2.2.1 过敏反应
• 2.2.2 hrp 基因与抗病的研究应用
• 2.2.2.1 hrp 基因的遗传组成
• 2.2.2.2 hrp 基因结构和功能保守性
• 2.2.2.3 hrp 基因的表达和调控
• 2.2.2.4 hrp 基因产物及其功能
• 2.2.2.5 hrp 基因与马铃薯广谱抗病基因工程
• 3 本研究的目的意义
• 第二章 马铃薯再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 外植体材料的准备
• 1.2.1.1 马铃薯无菌苗的快繁
• 1.2.1.2 马铃薯试管苗的复壮
• 1.2.2 再生体系的建立
• 1.2.2.1 茎段和叶片的再生和培养基筛选
• 1.2.2.2 芽的分化
• 1.2.2.3 外植体创伤方式与愈伤的发生
• 2 结果与分析
• 2.1 茎段、叶片愈伤组织的发生
• 2.2 芽的分化
• 2.3 外植体创伤方式与愈伤的发生
• 3 讨论
• 第三章 农杆菌介导马铃薯遗传转化体系的优化研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株与质粒
• 1.1.3 抗生素、选择试剂及其浓度设置
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化方法
• 1.2.1.1 农杆菌工程菌的培养和活化
• 1.2.1.2 外植体的预培养
• 1.2.1.3 外植体的转化
• 1.2.1.4 转化体的筛选和抗性芽的获得
• 1.2.2 遗传转化体系的优化
• 1.2.2.1 植物材料的生长状态对遗传转化的影响
• 1.2.2.2 受体材料Kan 选择压力的确定
• 1.2.2.2.1 对愈伤形成的选择压力
• 1.2.2.2.2 对生根的选择压力
• 1.2.2.3 茎段和叶片遗传转化的效果比较
• 1.2.2.4 工程菌浓度及侵染时间对遗传转化的影响
• 1.2.2.5 预培养时间对遗传转化的影响
• 1.2.2.6 共培养时间对遗传转化的影响
• 1.2.2.7 抗生素的抑菌试验
• 1.2.2.8 梯度筛选对遗传转化的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 植物材料的生理状态对遗传转化的影响
• 2.2 受体材料Kan 适合选择压力
• 2.2.1 愈伤诱导过程中Kan 适合浓度
• 2.2.2 生根过程中Kan 适合浓度
• 2.3 茎段与叶片遗传转化效果比较
• 2.4 工程菌浓度及侵染时间对遗传转化的影响
• 2.5 预培养时间对遗传转化的影响
• 2.6 共培养时间对遗传转化的影响
• 2.7 抗生素的抑菌效果及对遗传转化的影响
• 2.8 梯度筛选对遗传转化的影响
• 3 讨论
• 3.1 关于马铃薯基因转化受体系统的建立
• 3.2 菌种的活力对遗传转化的影响
• 3.3 农杆菌与再生之间的矛盾及农杆菌污染问题
• 3.4 农杆菌与外植体的共培养
• 3.5 抗生素对转化的影响
• 3.6 转化中采用两阶段选择培养的意义
• 第四章 glgC 基因的导入与转基因植株的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料与繁殖
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 酶和试剂
• 1.1.4 主要培养基的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒的PCR 鉴定
• 1.2.1.1 农杆菌质粒DNA 提取（碱裂解法）
• 1.2.1.2 PCR 鉴定
• 1.2.2 转glgC 基因马铃薯的培育
• 1.2.3 转基因马铃薯植株PCR 检测
• 1.2.3.1 马铃薯叶片总DNA 提取（SDS 法）
• 1.2.3.2 转化植株PCR 检测
• 1.2.4 转化植株总DNA 的Southern 检测
• 1.2.5 转基因植株的RT-PCR 检测
• 1.2.5.1 转基因植株微型薯的获得
• 1.2.5.2 马铃薯块茎总RNA 的提取
• 1.2.5.3 转基因植株RT-PCR 检测
• 1.2.6 转基因植株AGPase 酶活性、淀粉和还原糖的提取与测定
• 1.2.6.1 AGPase 的提取和活性测定
• 1.2.6.2 淀粉提取与含量测定
• 1.2.6.3 还原糖含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒的PCR 鉴定
• 2.2 转基因马铃薯植株再生
• 2.3 转基因植株PCR 鉴定
• 2.4 转基因马铃薯Southern 杂交鉴定
• 2.5 转基因植株的RT-PCR 检测
• 2.6 转基因马铃薯块茎AGPase 活性、淀粉和还原糖含量测定分析
• 3 讨论
• 第五章 hrp 基因的导入与转基因植株的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料与繁殖
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 酶和试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒的PCR 鉴定
• 1.2.2 马铃薯遗传转化和植株再生
• 1.2.3 转基因马铃薯植株PCR 检测
• 1.2.4 转基因马铃薯的Southern 杂交检测
• 1.2.5 转基因植株的RT-PCR 检测
• 1.2.5.1 马铃薯叶片总RNA 的提取
• 1.2.5.2 转基因植株RT-PCR 检测
• 1.2.6 转hrp 基因植株抗病性测定
• 1.2.6.1 P.infestans 接种物制备
• 1.2.6.2 Erwinia persicinus 接种物制备
• 1.2.6.3 接种方法
• 1.2.6.4 病斑生长速率（Lesion Growth Rate，LGR）测量、记录及统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒的PCR 鉴定
• 2.2 转基因马铃薯植株再生
• 2.3 转基因植株PCR 鉴定
• 2.4 转基因马铃薯Southern 杂交鉴定
• 2.5 转基因植株的 RT-PCR 检测
• 2.6 转基因植株抗病性测定
• 3 讨论
• 第六章 讨论
• 1 马铃薯遗传转化中的几个问题
• 2 AGPase 基因与马铃薯高淀粉育种
• 3 拟过敏性反应与马铃薯广谱抗病育种
• 4 马铃薯基因工程尚存的不足
• 结 论
• 图 版 Ⅰ
• 图 版 Ⅱ
• 图 版 Ⅲ
• 图 版 说 明
• 参考文献
• 附录 博士在读期间发表论文
• 致 谢
• 导师简介
• 作者介绍