永州市中心医院北院心胸血管外科湖南永州425000
【摘要】目的探讨KIAA0101mRNA在食管癌患者全血中表达的临床病理学意义。方法本研究选取了连续纳入36个月内在永州市中心医院北院就诊的77例被确诊为食管癌的患者，30例食管平滑肌瘤患者和40例健康志愿者被选入对照组。采集所有患者和对照组受试者全血并用EDTA抗凝，采用实时定量PCR技术检测KIAA0101mRNA表达。结果与对照组受试者相比，食管癌组患者KIAA0101mRNA高表达。KIAA0101mRNA高表达与远端转移，分期晚密切相关。KIAA0101mRNA的灵敏度和特异性均优于CYFRA21-1（细胞角化素蛋白片段）和CEA（癌胚抗原）。结论KIAA0101mRNA能够用于食管癌诊断和预后预测。
【关键词】KIAA0101；食管癌；甲胎蛋白；癌胚抗原
引言
食管鳞状细胞癌（以下简称食管癌）是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，其5年生存率小于30%。其发生与亚硝胺的慢性刺激、饮水、粮食蔬菜中微量元素的含量、炎症与创伤以及遗传因素有关［1］。KIAA0101是分子量为15kDa的蛋白质，含有增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的保守结合结构域，并参与DNA修复调控、细胞周期进程、细胞凋亡和细胞增殖[2]。本研究旨在探讨KIAA0101mRNA在食管癌患者全血中表达的临床病理学意义。
1研究对象与方法
1.1研究对象
77例食管癌患者和30例食管平滑肌瘤患者的石蜡组织标本，收集自2000年1月至2004年12月就诊于永州市中心医院胸外科实施手术的患者。所有患者术前均未行化疗或放疗，均有完整的临床病理资料。
1.2单核细胞分离
应用密度梯度离心法，从4mL肝素抗凝外周血中提取单核细胞。用生理盐水稀释外周血至8mL，分装至2个EP管，各加人2mL淋巴细胞分离液后以900g离心。室温孵育30min后，外周血单核细胞便处于中间层。吸取中间层细胞，于离心管中稀释至10mL，离心2次，并在每次离心后室温孵育10min。移除上清后，将外周血单核细胞于-70˚C保存。
1.3KIAA0101mRNA的扩增
采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂盒提取外周血单核细胞中RNA。主要过程为：95˚C预变性5min，37˚C逆转录30min，94˚C变性35S，56˚C退火45S，72˚C延伸60S，共35个循环，72˚C末延伸7min。GAPDHmRNA作为内参。KIAA0101mRNA的扩增引物为：上游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGAAAGT-3’；下游引物5’-GTcGTATccAGTGcAGGGTccGAGGT-3’。期望的产物大小为525bp。GAPDHmRNA的扩增产物为：上游引物5’-GCAACCCGTAGATCCGAACTTT-3’；下游引物5’-ATTCGCACTGGATACGAAAC-3’。期望产物大小为408bp。扩增产物用2％凝胶电泳分离。302nm紫外线下观察分离产物。KIAA0101mRNA表达=KIAA0101mRNA光密度/GAPDHmRNA光密度。
1.4统计分析
结果表示为平均值±标准差（SD）。使用卡方检验、t检验或单因素方差分析进行组间比较。逐步逻辑回归法分析不同因素对KIAA0101mRNA表达影响。受试者工作特征曲线用于预测临界值，计算标记物灵敏度，特异性，阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。所有检验均为双侧检验，p<0.05具有统计学差异性。使用SPSS19.0软件包（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）分析数据。
2结果
2.1患者一般特征
3讨论
本组77例食管癌患者中有52例（67.5%）KIAA0101mRNA高表达。本结果与ChengY等[3]研究结果类似，ChengY等研究表明HCC患者中KIAA0101mRNA和蛋白1的阳性表达率分别为61%和64%。
与食管癌组中67.5%的患者KIAA0101mRNA高表达相比，本研究食管平滑肌瘤对照组中30例患者中仅2例（6.67%）KIAA0101mRNA高表达，提示KIAA0101在恶性和良性食管疾病中表达存在差异，提示KIAA0101基因对于预测食管癌具有高特异性。以往研究表明，晚期食管癌具有强的血管浸润和转移潜能。此外，KIAA0101表达被认为可以促进癌细胞生长，且与P53突变以及血管浸润有关[4]。总之，这些发现表明KIAA0101参与食管癌浸润和转移过程，这一观点与本研究认为的KIAA0101mRNA表达与远端转移和晚期相关是一致的。ChengY等研究结果[3]也支持本结果，该研究发现KIAA0101过表达食管癌患者进展至晚期（IIA到IV）的发生率是KIAA0101低表达食管癌患者的2倍。
本研究表明KIAA0101mRNA过表达与年龄更大相关（P=0.005，），但是与CYFRA21-1或CEA的表达无关，这一研究结果与其他研究结果不一致，有些研究[5]发现KIAA0101mRNA过表达在较为年轻患者中更加普遍，且KIAA0101mRNA过表达与CYFRA21-1含量更高有关。造成研究结果不一致的原因可能是与研究对象地域差异和引起食管癌的病因不同有关。
本研究拟通过检测食管癌、食管平滑肌瘤和健康对照组受试者KIAA0101mRNA的不同表达率，并比较KIAA0101mRNA、AFP和CEA食管癌诊断的准确度、灵敏度和特异度，以评估食管癌患者血清中KIAA0101mRNA表达作为食管癌生化标志物的价值，结果表明食管癌患者全血KIAA0101mRNA表达食管癌诊断的灵敏度和特异度高于AFP和CEA。KIAA0101mRNA表达对于区分食管癌和非食管癌（食管平滑肌瘤患者和正常对照组受试者）的灵敏度和特异性分别为70%和97%，也优于AFP和CEA。由于外周血单个核细胞（PBMCs）采集简便易行，且属于非创伤性操作，能够重复进行，测定食管癌患者全血中敏感性标记物可以提供快速诊断线索，无需进一步创伤检查。PBMCs含有免疫细胞，如淋巴球，单核细胞和树突细胞，在抵抗宿主中的各种异常情况（如恶性肿瘤，肿瘤增殖和浸润）而发生的宿主免疫反应中起到了重要的作用。
总之，与对照组相比，KIAA0101mRNA在食管癌患者全血中的表达水平更高，比CYFRA21-1诊断食管癌的灵敏度和特异性更强，KIAA0101可能是潜在的食管癌诊断标记物。本研究发现KIAA0101mRNA与肿瘤分期晚等肿瘤进展预后因子具有相关性，提示KIAA0101具有成为食管癌疾病进展生物标志物的潜能，但这一结论需要进行更大样本量研究证实。
References：
[1]尤鑫（综述），祝淑钗（审校）.我国食管癌临床分期现状与思考[J].中国肿瘤，2014，23（5）：389-393.
[2]李华，马文丽，左长清，等.KIAA0101基因在人非小细胞肺癌中的功能预测[J].南方医科大学学报，2010，30（1）：157-159..
[3]ChengY，LiK，DiaoD，etal.ExpressionofKIAA0101proteinisassociatedwithpoorsurvivalofesophagealcancerpatientsandresistancetocisplatintreatmentinvitro.[J].LaboratoryInvestigation，2013，93（12）：1276-87..
[4]张彩凤，夏永华，郑庆芬，等.KIAA0101在胃癌细胞中的表达及其对胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭力的影响[J].中华病理学杂志，2012，41（8）：553-557.
[5]YuP，HuangB，ShenM，etal.p15（PAF），anovelPCNAassociatedfactorwithincreasedexpressionintumortissues.[J].Oncogene，2001，20（4）：484-489.