不同来源乳酸杆菌生物学特性比较研究

论文摘要

乳酸菌是革兰氏阳性菌,无芽孢,触媒阴性,细胞色素缺失,兼性厌氧,耐酸,在糖发酵时行严格的发酵方式,终产物以乳酸为主。目前,已经报道分离获得乳酸杆菌属乳酸杆菌40余种,被广泛应用于食品工业、畜牧业、制药工业中。本研究旨在从畜禽肠道、青贮玉米、泡菜等不同样品中筛选乳酸杆菌菌株,并研究其生物学特性,为益生菌及重组乳酸工程菌的宿主菌构建奠定理论基础,提供适宜宿主菌基础材料。获得的主要研究结果如下:1.采用2%CaCO2-MRS培养基,从山羊瘤胃液、玉米青贮料、泡菜以及成年鸡的消化道内分离得到了20株乳酸杆菌,经过革兰氏染色和16SrDNA保守序列分析对其进行了鉴定:其中,有10株是从鸡消化道中分离出的,包括5株罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、3株卷曲乳杆菌（Lactobacillus curl）、2株瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）;有4株乳杆菌是从山羊瘤胃液和粪便中分离出的,包括2株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、1株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和1株罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）;有2株是从泡菜中分离出的,均为罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）;有4株是从青贮玉米中分离出的,均为罗伊乳杆菌（Lactobacillus reuteri）。2.将分离鉴定的20株乳酸杆菌用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒后进行凝胶电泳,经检测,含有质粒的共有7株（QZ5、QZ7、PC1、JXQ2、JXH1、SN1、YF2）,且均为罗伊乳杆菌,分别来源于青贮玉米（QZ5、QZ7）、泡菜（PC1）、鸡消化道（JXQ2、SN1、JXH1）、羊粪（YF2）;在40、60、80℃水浴中分别处理20 min、40 min、70 min后涂布MRS平板计数,60℃处理20min后, PC1、QZ7的存活率在10%20%,其他菌株在处理20 min和40 min后均有75%以上的存活率,处理60 min后,仍有30%50%的存活率;将这7株乳酸杆菌接种在不同pH和胆盐含量的培养基培养中,经24 h培养发现:pH2-3之间,PC1、JXH1的OD值在0.10.4之间,其他菌株均在0.10.2之间; JXH1、JXQ2、YF2在0.60.8%的胆盐浓度中的存活率是其他菌株的2倍。3.通过琼脂板打孔法对乳酸杆菌培养物上清液的抑菌性进行研究,结果显示,这7株乳酸杆菌上清液能够有效抑制其它致病菌的生长繁殖,其中对于蜡样芽孢杆菌的抑菌效果最为明显,对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用。4.采用药敏纸片琼脂扩散法对含有质粒的7株乳酸杆菌的药敏性进行检测,结果表明:这7株乳酸杆菌对青霉素类、头孢菌素类、呋喃类、大环内酯类、利福平、壮观霉素、氯霉素等几类抗生素普遍敏感,对磺胺类、多肽类、喹诺酮类菌具有抗药性。只有4株（JXQ2、YF2、JXH1、SN1）对呋喃类,利福平、壮观霉素比较敏感,3株（YF2、JXH1、SN1）对头孢菌素类也较敏感,3株（PC1、QZ7、QZ5）对四环素类不敏感,但是,对其他抗生素均敏感。5.把含有质粒的7株乳酸杆菌与培养的CaCo-2结肠癌细胞一起进行体外黏附试验,扫描电镜下的计数结果表明:PC1、QZ5、SN1、JXQ2、YF2、JXH1对CaCo-2的黏附个数平均在8.09.5个/细胞,而QZ7的黏附个数平均在5.0个/细胞以下。综合以上试验结果,认为来源于成年鸡消化道的JXQ2、YF2、JXH1菌株和来源于羊粪的SN1菌株可以作为理想的乳酸杆菌宿主菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳酸杆菌的分类及其系统发育
• 1.2 乳酸杆菌生理功能简介
• 1.2.1 提高机体免疫力
• 1.2.2 拮抗作用
• 1.2.3 提供营养物质
• 1.3 乳酸杆菌的主要应用领域及进展
• 1.3.1 乳酸杆菌在食品工业领域的应用
• 1.3.2 乳酸杆菌在饲料工业领域的应用
• 1.4 乳酸杆菌在畜禽生产中的应用
• 1.4.1 乳酸杆菌对猪生产性能的影响
• 1.4.2 对肉鸡生产性能的影响
• 1.4.3 对蛋鸡生长性能的影响
• 1.5 乳酸杆菌作为基因工程菌的研究进展
• 1.6 本研究的目的及意义
• 1.7 试验技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品的采集与处理
• 2.1.2 参考菌种和细胞
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 主要培养基的配制
• 2.2.2 主要溶液的配制
• 2.2.3 乳酸菌的初筛
• 2.2.4 细菌的16SrDNA 鉴定
• 2.2.5 乳酸杆菌质粒DNA 的提取
• 2.2.6 乳酸杆菌耐热性试验
• 2.2.7 乳酸杆菌的耐酸性试验
• 2.2.8 乳酸杆菌的胆盐耐受性试验
• 2.2.9 乳酸杆菌的抑菌性试验
• 2.2.10 乳酸杆菌的抗生素敏感性试验
• 2.2.11 乳酸杆菌的黏附性试验
• 第三章 结果与分析
• 3.1 乳酸杆菌的分离鉴定
• 3.1.1 初筛结果
• 3.1.2 革兰氏染色结果
• 3.1.3 16SrDNA 鉴定结果
• 3.2 乳酸杆菌质粒DNA 结果
• 3.3 乳酸杆菌耐热性
• 3.4 乳酸杆菌耐酸性
• 3.5 乳酸杆菌胆盐耐受性
• 3.6 乳酸杆菌抑菌性
• 3.7 乳酸杆菌的耐药性
• 3.8 乳酸杆菌黏附性
• 第四章 讨论
• 4.1 乳酸杆菌的分离鉴定
• 4.2 乳酸杆菌宿主菌的选择
• 4.3 技术方法上的改进与不足
• 4.3.1 乳酸杆菌的质粒检测
• 4.3.2 乳酸杆菌的耐药性试验
• 4.3.3 乳酸杆菌的黏附试验
• 4.4 需要进一步深入的研究工作
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介