剪切修复偶联因子1（ERCC1）在大鼠脑缺血损伤病理过程中的作用研究

论文摘要

脑缺血后一系列的病理变化导致细胞DNA损伤,损伤的DNA若得不到及时修复导致细胞凋亡,从而加重缺血性脑损伤。缺血在导致DNA损伤的同时,也激活了自身的DNA修复系统。核苷酸剪切修复（nucleotideexcision repair,NER）是细胞内最普遍的DNA修复方式,它可修复各种因素导致的大片断DNA损伤,如紫外线、化学药物及氧化剂导致的DNA损伤。研究表明,剪切修复偶联因子1（excision repair cross complementing1,ERCC1）是NER途径中的核心因子之一,ERCC1缺失的小鼠DNA损伤明显重于野生型小鼠,并在断奶前即死亡。将ERCC1基因转入该缺失型小鼠可明显改善其病理症状。体外实验进一步证实,缺少ERCC1后细胞不能通过NER有效修复损伤的DNA,给予外源性ERCC1可恢复其修复功能。所以,ERCC1可能是NER过程中的一个重要的限速因子。为了研究ERCC1在缺血损伤脑内的表达及可能作用,我们采用免疫组化和Western blot等方法观察了ERCC1在正常大鼠脑内的表达和分布、在缺血脑内的表达及时程变化;为进一步研究ERCC1在缺血脑内表达的生物学意义,我们分别采用全长反义核酸抑制ERCC1表达和质粒转染过表达ERCC1蛋白,从正反两方面分析、研究ERCC1对缺血后DNA损伤修复和脑损伤的影响。现将实验结果概述如下:1.ERCC1在大鼠脑内的表达和细胞分布研究免疫组化的结果显示,ERCC1在大鼠脑内广泛分布,特别是皮层和纹状体。免疫双标结果显示:ERCC1的表达主要位于细胞核,与神经元标志蛋白MAP-2和星型胶质细胞标志蛋白GFAP均有共存,并以前者为多。这些结果表明ERCC1主要存在于神经元和星型胶质细胞的胞核内。2.缺血再灌大鼠脑内ERCC1表达变化的时程研究免疫印迹半定量分析（Western blot,WB）结果显示:皮层ERCC1的表达在缺血再灌1d时显著下降,再灌3d到14d又显著增加;纹状体的ERCC1表达在再灌3d时开始增加,并持续升高到再灌14d。免疫组化的结果显示,缺血再灌1d时,皮层和纹状体内ERCC1蛋白的表达都有一短暂性的下调趋势。随后,皮层ERCC1表达基本恢复至缺血前水平。但是,再灌14 d时,纹状体ERCC1表达显著高于正常水平。进一步观察发现,在缺血再灌1d时ERCC1免疫阳性细胞着色较浅,3d后着色加深,7d和14d时,着色深于正常组。另外,采用免疫组化双标的方法观察到,在缺血再灌14d时,缺血侧的ERCC1分别与MAP-2和GFAP共存。由此可见,缺血诱导脑内高表达ERCC1位于神经元和神经胶质细胞的胞核内。3.降低脑内内源性ERCC1表达加剧缺血性脑损伤大鼠大脑中动脉线栓（middle cerebral artery occlusion,MCAO）30min后,侧脑室内给予不同剂量的ERCC1 antisense质粒（pcDNA3-ERCC1-antisense）,动物分别于缺血再灌3 d和7 d时处死。免疫组化和免疫印迹分析结果显示,5μg和10μg pcDNA3-ERCC1-antisense均可显著降低内源性ERCC1蛋白的表达量。并且pcDNA3-ERCC1-antisense处理加剧大鼠皮层和纹状体内单链DNA的损伤,扩大脑梗塞灶体积。由此推测,缺血诱导的内源性ERCC1表达增加与损伤脑的自身修复密切相关。4.过表达ERCC1对缺血损伤脑的保护作用研究大鼠MCAO 30 min后,侧脑室分别给予5μg、10μg、15μg pEGFP-N1或ERCC1-EGFP质粒,EGFP免疫组化显示缺血后侧脑室给予ERCC1质粒可在脑内有效表达。与对照组比较,5μg ERCC1质粒注射后,对缺血损伤脑的梗塞灶体积没有影响,而10μg和15μg ERCC1质粒注射后,可显著缩小脑梗塞灶体积。提示在缺血脑内外源性高表达ERCC1具有明显的脑保护效应。小结:在成年大鼠脑内,ERCC1主要存在于神经元和神经胶质细胞的胞核内。在大鼠脑缺血再灌过程中,ERCC1时间依赖性地表达增加。ERCC1antisense抑制脑内ERCC1表达,可增加缺血损伤脑内单链DNA损伤和脑梗塞灶体积。外源性过表达ERCC1可减轻缺血性脑损伤,缩小脑梗塞灶体积。由此提示,缺血损伤脑内ERCC1表达的增加可能是损伤脑自我保护的内源性代偿机制之一。

论文目录

• 一、缩写词表（ABBREVIATIONS）
• 二、中文摘要
• 三、Abstract
• 四、正文
• （一）、引言
• （二）、材料和方法
• 1.材料
• 2.试剂来源
• 3.仪器
• 4.实验方法
• 4.1 大鼠大脑中动脉线栓（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型
• 4.2 缺血脑内ERCC1表达的时程变化研究
• 4.3 侧脑室内注射质粒
• 4.3.1 ERCC1 antisense质粒
• 4.3.2 ERCC1蛋白表达质粒
• 4.4 免疫印迹（Western blot）实验
• 4.4.1 蛋白提取
• 4.4.2 Western blot
• 4.5 脑组织切片和组织化学染色
• 4.5.1 冰冻组织切片的制备
• 4.5.2 Fluoro-Jade B染色
• 4.5.3 焦油紫（CV）染色
• 4.5.4 ERCC1免疫组织化学染色
• 4.5.5 EGFP免疫组织化学染色
• 4.5.6 ERCC1与MAP-2免疫组织化学双标记染色
• 4.5.7 ERCC1与GFAP免疫组织化学双标记染色
• 4.5.8 DNA聚合酶Ⅰ介导的脱氧尿嘧啶核苷酸缺口平移标记（DNA polymerase Ⅰ-mediated digoxigenin-dUTP nick-translation,PUNT）染色
• 4.6 数据统计与分析
• 4.6.1 Western blot半定量
• 4.6.2 细胞计数
• （三）、实验结果
• 1.正常大鼠脑内ERCC1的蛋白表达分布
• 2.缺血大鼠脑内ERCC1蛋白的时间依赖性表达
• 2.1 缺血大鼠脑内ERCC1蛋白表达的时程变化
• 2.2 缺血大鼠脑内ERCC1蛋白表达的区域和细胞分布特征
• 3.侧脑室注射ERCC1 antisense抑制内源性ERCC1的表达
• 3.1 ERCC1 antisense抑制ERCC1表达的剂量反应
• 3.2 ERCC1 antisense抑制ERCC1表达的时程反应
• 4.侧脑室注射ERCC1 antisense加重缺血性脑损伤
• 4.1 ERCC1 antisense减少脑内内源性ERCC1表达
• 4.2 ERCC1 antisense增加缺血脑内DNA损伤
• 4.3 ERCC1 antisense增加缺血性脑梗塞灶体积
• 5.ERCC1过表达对缺血损伤脑的保护作用
• 5.1 质粒在脑内有效表达的鉴定
• 5.2 ERCC1过表达减轻缺血性脑梗塞灶体积
• （四）、讨论
• 1.ERCC1参与正常脑内的DNA修复
• 2.ERCC1参与缺血脑内的DNA修复
• 3.内源性ERCC1表达上调对急性缺血脑损伤具有保护作用
• 4.对ERCC1通过NER途径发挥作用机制的探讨
• （五）、小结
• （六）、图版说明
• （七）、参考文献
• 五、文献综述
• 六、附录一 博士期间完成的另一部分工作（一）
• 七、附录二 博士期间完成的另一部分工作（二）
• 八、附录三 致谢
• 九、附录四 已发表和待发表的文章