基于PCR-DGGE技术的脱氮除磷系统微生物群落结构分析

论文摘要

本课题以废水脱氮除磷厌氧-缺氧-好氧系统（改进A-A-O工艺）为研究对象,采用PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）分子生物学技术对生物脱氮除磷系统活性污泥中微生物群落结构进行分析,研究并比较了三种活性污泥总DNA提取方法的提取效果。在此基础上,探讨了模式多聚反应物对微生物群落结构的影响。系统对于CODCr和总磷的去除效果都很高,CODCr的去除率大都在90%以上,总磷的去除率则达到了95%左右。而总氮的去除率平均在65%左右,处理效果不是很理想。对废水脱氮除磷系统中的活性污泥样品经过或未经预处理,比较了超声波法、玻璃珠震荡法和冻融法三种细胞裂解方法对DNA提取效果的影响。吸光度和琼脂糖凝胶电泳检测结果表明:活性污泥经TENP和PBS预处理后采用冻融法加2%SDS裂解细胞的DNA提取操作,可以得到数量多、纯度高的活性污泥DNA样品,可直接进行PCR扩增反应。采用PCR-DGGE技术对系统不同反应区段活性污泥微生物群落结构进行研究。DGGE图谱显示:系统活性污泥中存在着丰富的微生物种类,且群落结构也比较复杂。污泥的内外回流不可避免地造成了微生物在不同反应池中的“流动”,因此不同反应区段微生物群落结构基本相同。通过割胶、测序、NCBI比对初步确定:（1）活性污泥样品中获得的16S rDNA序列分别归属于三大细菌类群:变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacterium）和硝化螺旋菌属（Nitrospirasp.）;其中变形细菌和放线细菌为优势菌种。（2）系统的厌氧区、缺氧区和好氧区的菌群结构主要差异在放线菌（Actinobacterium）和变形细菌（γ-Proteobacteria）。放线菌在厌氧和缺氧区含量较高,而变形细菌在好氧区成为优势菌种。结合进出水水质,在分子生物学角度证实了微生物在污水处理过程中明显的脱氮除磷作用。采用超滤膜法对废水处理系统中有机物的分子量分布及其变化进行研究,分析有机物分子量分布特性及不同分子量分布区间有机物的相对含量。结果表明:厌氧、缺氧、好氧反应池出水中,小于1K分子量区间上的有机物所占比例最高。结合DGGE分析模式多聚反应物对系统微生物群落结构的影响。DGGE图谱表明:系统各反应池微生物种群结构没有发生明显改变,仅有少数菌种的数量表现出较为简单的规律性变化,表明生物脱氮除磷过程中的微生态系统在模式多聚物条件下的稳定性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 氮、磷危害及主要生物脱氮除磷工艺
• 1.1.1 氮污染及危害
• 1.1.2 磷污染及危害
• 1.1.3 生物脱氮除磷工艺研究进展
• 1.2 环境微生物及微生物分子生态学研究状况
• 1.3 微生物群落结构分析方法研究进展
• 1.3.1 荧光原位杂交（FISH）
• 1.3.2 Real-Time PCR定量测定技术
• 1.3.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.4 课题研究意义、主要内容及技术路线
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 主要研究内容
• 1.4.3 研究技术路线
• 2 改进A-A-O系统稳定性研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验样品
• 2.1.2 试验装置
• 2.1.3 试验设备
• 2.2 试验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 小结
• 3 DNA提取与纯化技术研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 活性污泥样品
• 3.1.2 实验药品与试剂
• 3.1.3 实验仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 污泥样品预处理
• 3.2.2 细胞裂解
• 3.2.3 DNA的提取
• 3.2.4 提取DNA的测定
• 3.2.5 PCR扩增
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 预处理方法及细胞裂解方法比较
• 3.3.2 不同SDS浓度细胞裂解效果检验
• 3.3.3 PCR扩增结果分析
• 3.3.4 DNA提取与系统处理效率分析
• 3.4 小结
• 4 改进A-A-O系统微生物群落结构分析
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 活性污泥样品
• 4.1.2 实验试剂和仪器设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 样品总DNA的提取与纯化
• 4.2.2 PCR扩增
• 4.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 活性污泥样品总DNA的提取与纯化
• 4.3.2 样品总DNA的PCR扩增
• 4.3.3 变性梯度凝胶电泳条件优化
• 4.3.4 细菌16S rDNA V3区特征片段DGGE结果
• 4.3.5 细菌16S rDNA测序结果和聚类分析
• 4.4 小结
• 5 模式多聚反应物对微生物群落结构影响分析
• 5.1 模式多聚物降解产物的分子量分布
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.3 结果与讨论
• 5.2 模式多聚物条件下系统微生物群落结构PCR-DGGE研究
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.3 结果与讨论
• 5.3 小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢