论文摘要
绝经后骨质疏松症是中老年妇女的常见病、多发病,骨康防治骨质疏松症具有良好的疗效,但其具体作用机理尚未阐释清晰,尤其是其对MSCs成脂分化的影响目前尚未见实验报道。目的体外培养骨质疏松大鼠MSCs,通过成脂分化诱导剂促使MSCs成脂分化,不同浓度骨康含药血清进行干预,与尼尔雌醇含药血清干预对照,探讨骨康含药血清对绝经后骨质疏松症大鼠骨髓基质干细胞成脂分化过程中PPARγ基因表达的影响。方法动物试验研究：24只6月龄SPF级SD雌性大鼠,行双侧卵巢切除术后常规喂养12周；随机取3只尼尔雌醇灌胃制备含药血清；9只不同剂量骨康灌胃制备含药血清,余12只处死制备MSCs。MSCs传代纯化后随机分为8组,分别是：模型组,成脂诱导组,单纯西药组,成脂诱导西药组,单纯中药组,成脂诱导中药低剂量组、成脂诱导中药中剂量组、成脂诱导中药高剂量组。分别于成脂诱导第7、14天,各组取出细胞玻片行油红0染色,染色完成后光镜观察；RT-PCR法检测细胞中PPARγ的mRNA表达；Western blot测定细胞中PPARγ蛋白含量。临床研究：自2010年3月始至2010年10月份期间,在广州中医药大学附属骨伤科医院门诊及住院部,选择经临床检查确诊为绝经后骨质疏松症患者87例。10名20-30岁未婚健康青年女性为正常对照组（A组）,符合条件的研究对象以及健康女性进行血清中PPARγ水平。对骨质疏松组的患者按照绝经年限进行分组,每5年为一个等级,分为6组,分别为B、C、D、E、F组,其对应绝经年限依次为2-5年、5-10年、10-15年、15-20年、20年以上。观察实验对象的血清PPARγ水平和绝经年限,探讨绝经期后骨质疏松症患者绝经年限与PPARγ的相关性。结果试验研究：（一）成脂分化各组施加干预措施7天后,与模型组比较,成脂诱导组呈极显著性差异（P<0.01）,成脂诱导西药组、成脂诱导中药各组均呈显著性差异（P<0.05）；与成脂诱导组比较,成脂诱导西药组、成脂诱导中药低、中剂量组有显著性差异（P<0.05）,成脂诱导中药高剂量组呈显著性差异（P<0.01）；单纯中药组与单纯西药组比较无差异（P>0.05）,成脂诱导西药组与成脂诱导中药各组比较均无差异（P>0.05）。干预实施14天后,与模型组比较,成脂诱导组有显著性差异（P<0.05）,其它各组无差异（P>0.05）；与成脂诱导组比较,单纯西药、中药组呈极显著性差异（P<0.01）；成脂诱导西药组、成脂诱导中药各剂量组与成脂诱导组比较差异显著（P<0.05）。成脂诱导中药各组组间比较差异无显著性意义（P>0.05）。成脂诱导西药组与成脂诱导中药各组比较差异无显著性意义（P>0.05）。单纯西药组与成脂诱导西药组比较差异不显著（P>0.05）；单纯中药与成脂诱导中药低、中、高组比较呈显著性差异（P<0.05）。干预7天与14天前后对比发现,各组干预后第14天成脂率均较第7天有所增长,但组内前后对比统计学无差异（P>0.05）。（二） PPAR y mRNA表达干预7天后,与模型组比较,单纯西药组、成脂诱导西药组、中药高剂量组PPARγmRNA表达均有下降,差异显著（P<0.05）；中药低剂量组PPARγmRNA表达较模型组明显降低（P<0.01）；单纯中药组、成脂诱导中药中剂量组PPARγmRNA表达较模型组也有降低趋势,但统计学分析无显著性差异（P>0.05）。与成脂诱导组比较,成脂诱导中药低剂量组PPARγmRNA表达明显降低（P<0.01）,成脂诱导中药高剂量组、成脂诱导西药组PPARγmRNA表达降低具有显著性差异（P<0.05）,其余各组比较统计学差异不显著（P>0.05）。单纯西药组与单纯中药组比较,单纯西药组抑制PPARγmRNA表达优于后者（P<0.05）,与成脂诱导西药组比较,无显著性差异（P>0.05）。成脂诱导西药组与成脂诱导中药各组比较统计学分析无显著性差异（P>0.05）。与单纯中药组相比,成脂诱导中药低、高剂量组和成脂诱导西药组抑制PPARγmRNA表达具有极显著或显著性差异（P<0.01,P<0.05）。与中药中剂量组相比,以低、高剂量组抑制PPARγmRNA表达极显著或显著性差异（P<0.01,P<0.05）；干预14天后统计学后,与模型组比较,成脂诱导组PPARγmRNA表达无显著性差异（P>0.05）,其余各组均呈显著性差异（P<0.05）。与成脂诱导组比较,单纯中药组PPARγmRNA表达无显著性差异（P>0.05）,单纯西药组、成脂诱导西药组、成脂诱导中药中剂量组呈显著性差异（P<0.05）,成脂诱导中药低、高剂量组统计学分析具有非常显著性差异（P<0.01）。单纯西药组与单纯中药组PPARγmRNA表达比较无显著性差异（P>0.05）。与成脂诱导西药组比较,成脂诱导中药低、高剂量组PPARγmRNA表达明显降低,具有非常显著性差异（P<0.01）。与单纯中药组比较,成脂诱导中药低、高剂量组具有显著性差异（P<0.05）。成脂诱导中药各组中,与中药中剂量组相比,以低剂量组抑制PPARγmRNA表达有显著性差异（P<0.01）；中药高剂量有显著性差异（P<0.05）。干预后第7天与第14天比较,成脂诱导组PPARγmRNA表达呈现明显上升趋势（P<0.05）；成脂分化油红染色结果14天干预后成脂诱导组成脂率亦有上升,但统计学分析差异不显著（P>0.05）；其余各组PPARγmRNA表达均呈下降趋势,但统计学分析无显著性差异（P>0.05）。（三） PPARγ蛋白检测经过7天干预之后,成脂诱导中药低、高剂量组PPARγ蛋白表达最低,成脂诱导西药组其次；单纯中药、成脂诱导中药中剂量组PPARγ蛋白表达最高,成脂诱导组其次。干预14天后,模型组、单纯中药组PPARγ蛋白表达最高,成脂诱导组其次；PPARγ蛋白表达最低组依然为成脂诱导中药低、高剂量组。所有8个分组经过干预7、14天后,各组PPARγ蛋白表达定量分析结果显示,模型组、成脂诱导组PPARγ蛋白表达均有较大幅度升高；单纯中药组干预后7、14天PPARγ蛋白表达呈现下降趋势,但与其它组比较表达偏高。成脂诱导中药低、高剂量组PPARγ蛋白表达均最低,成脂诱导西药组其次。临床研究：血清中PPARγ浓度亦在绝经的最初15年明显升高,在绝经的十五年以后趋于稳定（B组、C组、D组与A组、E组、F组组间比较,P<0.05；B组、C组、D组组间比较,P>0.05；A组、E组、F组组间比较P>0.05；）,经相关分析,血清中PPARγ浓度与绝经年限未存在明显相关性,Spearman相关系数Yp=5.870,相关系数经检验后P>0.05。结论试验研究结论：中药骨康低、高浓度含药血清可以减少骨质疏松大鼠MSCs分化脂肪细胞的数量,降低PPARγmRNA及其蛋白表达,从而起到阻止骨质疏松大鼠MSCs成脂分化,促进其成骨分化,其疗效与尼尔雌醇效用相仿。临床研究结论：在绝经的最早十五年内血清中PPARγ浓度明显较健康女性升高。在绝经的后十五年以后血清中PPARγ浓度趋于稳定。