论文摘要
背景钙网蛋白（Calreticulin ,CRT）是内质网和肌浆网中主要的钙结合蛋白,具有分子伴侣、调控细胞内钙稳态、蛋白质合成和修饰等多种功能,参与生物体内多种生理和病理过程,与心脏发育和多种心血管疾病的发生、发展和预后密切相关。已有研究发现钙网蛋白基因缺失（crt-/-）胚胎小鼠可出现心脏发育不全,心室壁变薄,甚至胎死宫内,原因可能与细胞外基质含量变化有关;基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）是一组能降解细胞外基质与胶原的锌依赖蛋白酶家族,在调节心脏细胞外基质与胶原方面具有重要作用。本课题组前期研究发现与野生型（wt）胚胎小鼠成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）比较,crt-/-胚胎小鼠成纤维细胞MMP-2活性表达增高,而MMP-9的活性表达明显减弱,这可能是crt-/-小鼠心脏发育不全的原因之一,但是具体机制尚未阐明。前期研究还发现c-Jun氨基端激酶（JNK）在crt-/-胚胎小鼠成纤维细胞中的活化明显高于wt胚胎小鼠成纤维细胞,我们推测JNK信号转导途径参与了MMP-2/9的活性表达,导致心肌细胞外间质与胶原含量的改变,从而引起心室壁变薄,心脏发育不全。因此本实验在上述原创性发现的基础上,进一步探索JNK信号转导通路在crt-/-小鼠MMP-2/9改变中所起的作用,并探讨导致MMP-2/9改变的细胞内的作用机制,为阐明心脏形成、发育及相关病理过程提供新的理论依据,并为临床疾病的治疗提供新的方向。目的体外培养胚胎小鼠成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast cells ,MEF）野生株（wide type ,wt）和钙网蛋白基因敲除株（calreticulin null ,crt?/?）,基于前期研究,探讨JNK信号转导通路是否参与钙网蛋白基因缺失型细胞MMP-2和MMP-9活性的改变以及调节活性变化的机制。方法将实验分为对照组和实验组,对照组中不加入JNK信号通路的激动剂anisomycin,实验组分为4组,分别加入JNK信号通路的激动剂anisomycin（1,5,10,50ng/ml）作用于wt及crt-/-胚胎小鼠成纤维细胞,依次于6,12,24小时后收集培养基和细胞总RNA,利用明胶酶谱法及实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RTQ-PCR）,分别从蛋白活性及基因水平上观察MMP-2和MMP-9的改变。结果1. JNK激动剂对MMP-2和MMP-9的mRNA水平的影响:10ng/ml anisomycin作用6h后,wt及crt-/-细胞的MMP-2/9 mRNA水平较对照组均下降且有统计学意义。2. JNK激动剂对MMP-2和MMP-9活性的影响:在加入10ng/ml anisomycin作用6h后,wt细胞的MMP-2及crt-/-细胞的MMP-2、9蛋白活性较对照组明显增加,且有统计学意义。10ng/ml anisomycin作用6h后wt细胞的MMP-9及不同浓度anisomycin（1,5,10ng/ml）作用12h、24h后wt和crt-/-细胞MMP-2,9活性较对照组均有不同程度的增加,但无统计学意义,而50ng/ml作用12h、24h后wt细胞的MMP-9活性及crt-/-细胞的MMP-2活性较对照组均下降,且有统计学意义。crt-/- MMP-2及wt MMP-9活性随着时间的延长而增加,wt MMP-2及crt-/- MMP-9活性随着时间的延长先增加后降低。6h较12h、24h比较均有统计学意义,12h和24h间比较无统计学意义。3. JNK激动剂作用后两株细胞间MMP-2和MMP-9的比较:10ng/ml anisomycin作用6h后MMP-9蛋白活性及anisomycin（1,5,10ng/ml）作用12h、24h后,MMP-2/9蛋白活性分别各自在两株细胞间比较有统计学意义, wt表现为MMP-2低表达,MMP-9高表达; crt-/-表现为MMP-2高表达,MMP-9低表达。10ng/ml anisomycin作用6h后MMP-2蛋白活性及50ng/ml anisomycin作用12h、24h后MMP-2/9蛋白活性在两株细胞间比较无统计学意义。结论1、在anisomycin 10ng/ml作用6小时情况下,JNK信号转导通路参与了wt及crt-/-细胞中MMP-2的活性调节。2、在anisomycin 10ng/ml作用6小时情况下,JNK信号转导通路参与了crt-/-细胞中MMP-9的活性调节,而对wt细胞MMP-9的活性调节不明显,可能还有其他的信号转导通路参与了wt细胞MMP-9的调节。
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