PCOS与SLC30A8基因多态性的关联及雌激素对B细胞功能的调节作用

论文摘要

第一部分多囊卵巢综合征（PCOS）与SLC30A8基因多态性位点rs13266634的关联研究研究背景多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄期女性最常见的一种高度异质性的内分泌代谢紊乱性疾病,其临床表现多种多样,典型表现为不同程度的月经异常、卵巢多囊性改变、高雄激素血症、不孕、多毛、痤疮、肥胖等,并常伴有随年龄增长而日益明显的胰岛素抵抗/高胰岛素血症和高脂血症,常合并2型糖尿病和心血管疾病。PCOS的确切发病原因至今尚未阐明,可能与遗传和环境因素有关。PCOS具有明显的家族聚集性,这提示遗传因素在其发病中发挥了重要作用,该病可能是由多个基因异常和多种环境因素共同作用的结果。PCOS与2型糖尿病都属于多基因遗传病,都具有家族聚集性,其遗传学背景复杂多样,二者具有许多共同的遗传学特征。此外,PCOS和2型糖尿病在临床代谢表现和流行病学表现等方面也有许多相似之处,胰岛素抵抗/高胰岛素血症是这两种疾病共同拥有的病理生理学基础。研究资料表明,在患有PCOS的女性中,其2型糖尿病的发病率较不患有PCOS的女性显著升高。PCOS与2型糖尿病的相似性特别是遗传学特征的相似性提示我们,2型糖尿病的疾病相关基因可能也是PCOS的疾病相关基因,因此可以将2型糖尿病的疾病相关基因作为PCOS遗传易感性研究的候选基因。最近,在一个法国2型糖尿病人群中进行的全基因组研究中发现了一个新的2型糖尿病风险位点,即锌转运蛋白-8基因（SLC30A8）中的一个单核苷酸多态位点rs13266634（C）。SLC30A8基因位于8号染色体,其编码的蛋白质产物是锌转运蛋白家族的成员之一,即锌转运蛋白-8（ZnT-8）。ZnT-8仅在胰腺β细胞中的分泌颗粒内表达,是一种胰腺特异性的锌转运蛋白。锌在胰岛素的合成、转运、贮存和分泌中具有十分重要的作用,因此,ZnT-8这种胰腺特异性的锌转运蛋白的结构和/或功能异常很可能会对胰岛素的分泌产生影响,因而可能在2型糖尿病的发病中发挥一定作用。依据候选基因原理,我们假设,SLC30A8基因中的单核苷酸多态位点rs13266634（C）不仅是2型糖尿病的风险位点,同时也是PCOS的疾病相关位点。目的本研究通过分析比较rs13266634多态位点的基因型频率和等位基因频率在PCOS病例组与对照组中分布的差异,比较不同基因型的PCOS病人的内分泌及代谢特征表型的差别,研究单核苷酸多态位点rs13266634的不同基因型与PCOS不同临床表型的相关性,探讨SLC30A8基因在PCOS的发病及病理生理的变化过程中的相关作用,从而验证我们的假设是否正确。研究方法研究对象:本研究依据2003年鹿特丹标准选择PCOS患者894例,并选择622名健康的非糖尿病女性作为对照。分别测定PCOS患者的激素、生化指标、OGTT,测量身高、体重、腰围和臀围,计算体重指数（BMI）、腰臀比例及HOMA-IR指数。自肘静脉抽取外周血,抗凝处理后,提取全血基因组DNA。基因分型:本研究采用单管等位基因特异性PCR结合荧光溶解曲线分析的方法进行基因分型。根据方法原理设计一对等位基因特异性上游引物并共用一个相同的下游引物。PCR反应结束后立即进行荧光溶解曲线分析,根据曲线类型的不同进行基因分型。PCR反应及荧光溶解曲线分析在ABI 7500实时荧光PCR反应仪上进行。基因分型完成后,将所有被分型的标本中的2%进行测序,以确定该基因分型方法的准确性。统计学分析:计算病例组与对照组中rs13266634多态位点各基因型的频率及等位基因频率,Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验使用χ2检验来计算,病例组与对照组之间基因型频率与等位基因频率的比较采用χ2检验的方法。PCOS组中患者的内分泌及代谢特征表型与基因型的关联性分析采用协方差分析（ANCOVA）的方法,并将BMI作为协变量引入。结果1、在PCOS病例组和对照组中,单核苷酸多态位点rs13266634的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。2、在PCOS病例组与对照组中,rs13266634多态位点的基因型频率和等位基因频率的分布没有显著差异。3、在PCOS病例组中,rs13266634多态位点的基因型频率和等位基因频率在胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组患者中的分布没有显著差异。4、在PCOS病例组中,rs13266634多态位点的基因型频率和等位基因频率在肥胖组和非肥胖组患者中的分布没有显著差异。5、在PCOS病例组中,PCOS患者的各种内分泌及代谢特征表型与rs13266634多态位点的基因型分布之间没有相关性。结论SLC30A8基因中的单核苷酸多态位点rs13266634不是PCOS的疾病相关基因位点,未发现该位点的基因型分布与PCOS患者的内分泌及代谢表型特征表型之间存在相关性。第二部分雌激素对B细胞功能的调节作用研究背景系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统、多脏器,临床表现复杂多样,病程迁延反复的自身免疫性结缔组织病,由于患者体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物,可以造成组织损伤,临床上会出现各系统和脏器损害的症状。患者的自身抗原主要是细胞核内的不溶性（如组蛋白、DNA）和可溶性（如核糖核蛋白）成分、细胞膜成分（如红细胞、血小板表面抗原）、细胞内其他成分（如磷脂）等。患者体内的自身抗体主要有抗核抗体（ANA）、抗双链DNA（dsDNA）抗体、抗单链DNA（ssDNA）抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SSA（Ro）抗体、抗SSB（La）抗体、抗rRNP抗体、抗磷脂抗体等。有色人种比白种人发病率高,我国的患病率约为70/10万。本病女性患者约占90%,常为育龄期妇女,男女患病比为1:7～1:10。SLE的病因至今尚未被明确阐明,可能与遗传、环境、性激素等因素有关。SLE的发病机制中有许多因素的参与,至今的研究认为,SLE是在由遗传因素导致的遗传易感性的基础上,在病毒感染或体内激素环境改变等促发因素的作用下,机体的免疫系统发生功能紊乱,导致自身耐受丧失而引起的自身免疫性疾病。研究证明,多种免疫系统功能异常都在SLE的发病过程中发挥了重要作用,如,T、B细胞的过度活化,CD4+CD25+调节性T细胞等抑制性免疫调节细胞功能减退,干扰素（IFN）-α、IFN-γ、白细胞介素（IL） -6、IL-10等细胞因子分泌的异常,细胞凋亡异常,免疫复合物清除能力下降等。在众多机制中,患者体内B细胞过度活化,打破自身耐受,识别多种自身抗原,产生自身抗体,以及T、B细胞间相互作用的异常是SLE发病的核心事件。成熟的自身反应性B细胞产生的自身抗体以及循环中的免疫复合物可以直接造成机体组织器官的损伤,如皮肤和肾脏的损伤。B细胞还可以产生如肿瘤坏死因子（TNF）、IL-4、IL-10等促炎细胞因子,促进炎症反应。B细胞还可以作为抗原提呈细胞（APC）提呈抗原,表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子和CD80、CD86分子等,从而影响其他免疫细胞的功能。B细胞功能异常可以独立于其他危险因素诱发狼疮样症状,B细胞这一经典的免疫效应细胞已经成为SLE治疗的潜在靶点。SLE具有明显的女性倾向,育龄期男女患病比为1:9,而在绝经期男女之比仅为1:3,女性的非性腺活动期（＜13岁,＞55岁）,SLE的发病率显著减少。这种倾向可能与女性激素（如雌激素、孕激素等）的作用有关,在众多的女性激素中,雌激素的作用最为重要,雌激素是SLE发病的危险因素之一。雌激素具有免疫调节作用。一般认为,生理水平的雌激素具有免疫活化作用,而高于生理水平的雌激素则具有免疫抑制作用。在中枢免疫器官,雌激素可以调节胸腺的发育和骨髓中各种免疫细胞前体细胞的发育。在外周免疫器官,雌激素可以调节多种成熟免疫细胞如T、B细胞、树突状细胞（DC）、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、粒细胞等的功能,可以抑制Th-1型细胞因子的分泌并促进Th-2型细胞因子的分泌。总的来说,雌激素的免疫调节作用是倾向于抑制细胞免疫而促进体液免疫。雌激素具有的免疫调节能力,特别是对B细胞功能的影响很可能是SLE发病的女性倾向特征的发生机制之一。目前的研究主要集中在雌激素对B细胞发育过程中的自身耐受形成的干扰作用,而在雌激素对外周成熟B细胞的功能的影响方面,目前尚未有全面的研究。在本研究中,我们着眼于雌激素对外周成熟B细胞功能的调节作用。目的通过研究雌激素对雌性BALB/c小鼠脾脏B细胞的增殖、活化、凋亡、分化及抗体合成功能的影响,全面观察雌激素对外周成熟B细胞功能的潜在调节作用,从而探讨雌激素在SLE的发病和病情进展中可能发挥的作用。研究方法在无菌条件下分离雌性BALB/c小鼠的脾细胞,在无酚红、含10%炭吸附处理的胎牛血清（细胞凋亡研究时,使用的血清浓度为3%,炭吸附处理可以将血清中的小分子物质,如雌激素等除去）的液体RPMI 1640完全培养基中培养,并根据需要与不同浓度的(10-12mol/L～10-7mol/L)不含内毒素的、细胞培养级别的17β-雌二醇共培养,培养时间依据研究目的的不同而不同。小鼠脾细胞总IgG型抗体的合成用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测。小鼠脾脏B细胞的凋亡、活化及分化功能使用双色荧光染色流式细胞术检测,B细胞的增殖采用活细胞荧光染料染色及流式细胞术检测。使用流式细胞术检测时,将主要群体中的B220+细胞定义为B细胞。结果1、17β-雌二醇可使体外培养的小鼠脾细胞中的B220+/CD80+细胞减少,且可使B220+细胞表面CD80分子的表达密度降低,但17β-雌二醇对B220+细胞上CD86分子的表达没有影响。2、17β-雌二醇可使体外培养的血清缺乏诱导的小鼠脾B220+细胞的凋亡减少。3、17β-雌二醇可以使体外培养的小鼠脾细胞总IgG型抗体的合成增加。4、17β-雌二醇对体外培养的小鼠脾B220+细胞向浆细胞的分化没有影响。5、17β-雌二醇对体外培养的小鼠脾B220+细胞的增殖没有影响。结论雌激素可以促进B细胞的活化。雌激素下调小鼠脾B细胞上CD80分子的表达可能在提高B细胞活化能力中发挥了一定的作用。雌激素促进B细胞活化的能力在SLE患者的B细胞过度活化中发挥了重要作用,这可能是SLE发病的女性倾向特征产生的可能机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 多囊卵巢综合征（PCOS）与SLC30A8基因多态性位点rs13266634的关联研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 雌激素对B细胞功能的调节作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文题录
• 外文论文1
• 外文论文2