甲鱼虹彩病毒（STIV）病原学研究及检测方法的建立

论文摘要

甲鱼是我国重要的水产养殖品种,而“红脖子病”是甲鱼养殖中的常见病症,发病死亡率超过40%,严重时会引起甲鱼大量死亡,给养殖业带来严重损失。本研究对患“红脖子病”的甲鱼进行病毒分离,对分离到的病毒进行了形态学研究和理化特性研究,并建立了分子生物学和免疫学检测方法。详细内容如下:1.病毒的分离及理化特性研究。取典型的“红脖子”症状甲鱼的肝脏,经处理后制备的上清液接种到CO、FHM、CK和GCK细胞上出现CPE,进行空斑实验和理化性质分析。形态学研究发现,该病毒为结果表明直径约120～160 nm,呈二十面体对称有囊膜的球形病毒颗粒,病毒对热（56℃30分钟）、pH3和pH9不稳定,对脂溶剂（氯仿）敏感。该病毒在有DNA抑制剂存在的条件下受到抑制而不能增殖,表明该病毒核酸类型为DNA。病毒能在CO、FHM、CK、GCK等细胞中增殖,但不能在CHSE、R1、PG细胞中产生CPE。在CO细胞中的滴度最高,CPE出现也较快。病毒在15～30℃范围内均能在CO细胞中增殖并产生CPE,但最适增殖温度为25-30℃。通过形态学及理化特性研究,将分离到的病毒确定为虹彩病毒科,并将分离到的病毒命名为甲鱼虹彩病毒（soft-shelled turtle iridovirus,STIV）)2.克隆了STIV主要衣壳蛋白基因,对其序列进行分析,结果表明其与蛙病毒属中的FV3、ATV MCP基因同源性最高,因此将分离到的病毒确定为虹彩病毒科蛙病毒属。在体外STIV感染过程中,MCP的时相的表达模式通过Western-blot和实时荧光PCR实验检测,结果表明MCP为晚期基因。将MCP片段插入pQE30表达载体中,在大肠杆菌中表达MCP,并制备兔抗MCP多克隆抗体,间接免疫荧光和病毒中和实表明MCP抗血清对STIV具有中和作用。3.根据MCP基因序列中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光定量PCR反应条件进行优化,评估该分析方法的特异性、稳定性和重复性。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员（新加坡石斑鱼虹彩病毒除外）的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒（Lymphocystis）、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,检测总DNA灵敏度为4.5×100-3pg/μL。得到的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.9984;组内和组间试验重复样品的CT值标准偏差分别1.2%和1.6%。4.根据STIV胸肝激酶基因的保守序列,设计了两条内引物和两条外引物,建立了STIV环媒恒温扩增技术（LAMP）检测方法。对LAMP扩增条件优化,结果表明最佳反应条件为63℃反应60min。使用牛蛙病毒（TFV）、狗鱼弹状病毒（PFR）、传染性胰腺坏死病毒（IPNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性脑病和视网膜病病毒（VERV）、淋巴囊肿病毒（Lymphocystis）和真鲷虹彩病毒（RSIV）等主要水生动物病毒作为对照,评价LAMP方法的特异性,在蛙病毒属病毒毒株中均有扩增,检测其它病毒DNA时均为阴性。表明所建立的LAMP具有良好的特异性。灵敏度检测结果表明,LAMP检测比普通PCR扩增的灵敏度高100倍,比实时荧光PCR（real-time PCR）扩增的灵敏度低10倍。5.获得了4株可以稳定分泌STIV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了兔抗STIV多克隆抗体,建立检测STIV病原的双抗夹心ELISA方法。该方法具有良好的特异性和敏感性。用该ELISA方法对128份临床样品进行检测,同时用PCR作为对照方法,结果表明该ELISA方法的特异性和敏感性分别为98.3%和100%;ELISA和PCR两种方法检测结果的符合率为98.4%。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第1章 虹彩病毒综述
• 1.1 虹彩病毒形态结构
• 1.2 虹彩病毒科的分类及宿主种类
• 1.3 虹彩病毒基因组结构
• 1.4 虹彩病毒蛋白组结构及主要功能基因
• 1.5 虹彩病毒的增殖
• 1.6 蛙病毒属研究概况
• 1.6.1 蛙病毒属主要病毒
• 1.6.2 蛙病毒属的主要基因
• 1.7 本课题的目的和意义
• 第2章 甲鱼虹彩病毒（STIV）病毒分离及理化特性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病料和细胞系
• 2.1.2 病毒的分离和滴度测定
• 2.1.3 空斑试验
• 2.1.4 病毒的理化特性测定
• 2.1.5 病毒形态学观察
• 2.1.6 病毒的生物学特性测定
• 2.1.7 病毒的血清学鉴定
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 病原分离
• 2.2.2 病毒的理化特性
• 2.2.3 电镜观察
• 2.2.4 病毒的生物学特性
• 2.2.5 血清学鉴定
• 2.3 讨论
• 第3章 STIV主要衣壳蛋白基因序列分析及蛋白功能研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒与细胞系
• 3.1.2 STIV MCP序列测定
• 3.1.3 核酸序列的比较与系统进化分析
• 3.1.4 药物抑制测定
• 3.1.5 原核表达、纯化和多克隆抗体制备
• 3.1.6 间接免疫荧光法（IF）
• 3.1.7 病毒中和实验
• 3.1.8 WESTERN BLOT分析
• 3.1.9 STIV MRNA和病毒滴度的定量检测
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 PCR扩增
• 3.2.2 PCR产物的鉴定和序列测定
• 3.2.3 STIV MCP基因作为晚期基因的鉴定
• 3.2.4 MCP原核表达产物鉴定
• 3.2.5 MCP特异性抗血清的免疫荧光反应
• 3.2.6 体外中和实验
• 3.2.7 MCP基因在EPC细胞内表达的WESTERN-BLOT分析
• 3.2.8 RT-PCR检测MCP基因在两种不同细胞系中的表达谱
• 3.3 讨论
• 第4章 STIV实时荧光PCR检测方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 设备和试剂
• 4.1.3 引物和探针的设计与合成
• 4.1.4 病毒DNA的抽提
• 4.1.5 荧光定量PCR的建立和条件优化
• 4.1.6 荧光定量PCR的特异性实验、敏感性和重复性
• 4.2 结果
• 4.2.1 荧光定量PCR反应条件的优化
• 4.2.2 荧光定量PCR的特异性
• 4.2.3 荧光定量PCR与普通PCR灵敏度比较
• 4.2.4 相对标准曲线的建立
• 4.2.5 荧光定量PCR稳定性和重复性实验
• 4.3 讨论
• 第5章 STIV环媒恒温扩增检测方法的建立和应用
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 病毒
• 5.1.2 引物
• 5.1.3 病毒DNA的抽提
• 5.1.4 LAMP,PCR和real-time PCR反应条件的确定
• 5.1.5 LAMP特异性实验
• 5.1.6 LAMP、PCR和REAL-TIME PCR灵敏度的比较
• 5.1.7 LAMP的临床应用
• 5.2 结果
• 5.2.1 LAMP检测条件的确定
• 5.2.2 LAMP特异性实验
• 5.2.3.LAMP、PCR和real-time PCR的灵敏度比较
• 5.2.4 LAMP临床应用评价
• 5.3 讨论
• 第6章 STIV单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 病毒、细胞及试验动物
• 6.1.2 主要培养基和溶液的配制
• 6.1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）的相关试剂
• 6.1.4 分泌抗STIV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 6.1.4.1 病毒的大量培养及纯化
• 6.1.4.2 免疫原的制备
• 6.1.4.3 免疫
• 6.1.4.4 杂交瘤细胞的建立与阳性克隆的筛选
• 6.1.5 单抗的大量制备
• 6.1.6 单抗的纯化
• 6.1.7 单克隆抗体特异性
• 6.1.8 兔抗STIV多克隆抗体的制备
• 6.1.9 检测STIV ELISA方法的建立
• 6.1.10 ELISA特异性试验
• 6.1.11 临床样品检测
• 6.1.12 重复性试验
• 6.2 结果
• 6.2.1 杂交瘤的稳定性及分泌单抗的间接ELISA效价
• 6.2.2 单克隆抗体的特异性
• 6.2.3 单克隆抗体亚型的鉴定
• 6.2.4 ELISA特异性试验结果
• 6.2.5 批内重复性试验结果
• 6.2.6 批间重复性试验结果
• 6.2.7 临床样品检测结果
• 6.2.8 保质期试验结果
• 6.3 讨论
• 第7章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历