胆囊癌组织相关蛋白的筛选与鉴定

论文摘要

背景:原发性胆囊癌是恶性程度非常高的肿瘤,发病率有逐年上升的趋势,晚期胆囊癌5年生存率低于5%,而早期胆囊癌预后较好,5年生存率可高于80%,但无特异性临床表现,早期诊断困难,缺乏特异的诊断标志,临床上发现的早期胆囊癌多为意外性胆囊癌。胆囊结石并慢性胆囊炎是胆囊癌公认的危险因子,单个结石直径>3cm是导致胆囊癌发生的重要原因。胆囊癌合并有胆囊结石发生率可高达94%。结石嵌顿引起胆管阻塞使胆汁淤积引起胆囊黏膜慢性炎症、增生与胆囊癌的癌变过程有千丝万缕的关系。研究目的:在蛋白质组学水平筛选和鉴定与胆囊癌致病相关的差异蛋白,以期找到与胆囊癌诊断、治疗、预后相关的特异性标志物,发现胆囊癌诊疗的新颖靶点,更好的探讨和了解胆囊癌的发病机理。研究方法:本研究运用成熟的双向电泳-质谱鉴定技术,在10例原发性胆囊癌中,以胆囊结石并慢性胆囊炎、正常胆囊组织和部分癌旁正常胆囊组织作为对照,进行双向电泳实验,选取有代表的三次二维电泳实验结果,通过两两比较,满足组间三次平行电泳实验平均值±SD差大于2倍的条件,被认为差异表达,以此为标准筛选差异蛋白表达点。选取依照胆囊组-癌前病变组-正常对照组或有下调趋势,或有上调趋势的差异表达点进行PMF-MALDI-TOF/TOF质谱鉴定工作,鉴定的标准包括分子量、等电点、质谱检测肽段在整个蛋白质中的覆盖率、匹配度分值,蛋白得分大于56被认为有统计学意义（p<0.05）。鉴定数据经MASCOT检索,明确蛋白名称。在此基础上,选取部分感兴趣的上调和下调蛋白运用Realtime-PCR及其Western印迹方法从mRNA水平及蛋白质水平两个方面进行表达验证。最后,选取有潜在意义的蛋白在大样本的胆囊癌组织芯片中,进行免疫组化表达验证。以探讨蛋白之间的相关性以及与胆囊癌的临床病理学行为的关系及意义。结果:第一部分双向电泳试验中,以胆囊结石并慢性胆囊炎和正常胆囊、癌旁组织为对照,共寻找到66个与胆囊癌相关的差异表达点,其中在胆囊癌中上调表达点21个,下调表达点45个。26个蛋白差异点入选质谱鉴定工作,鉴定出21个差异表达蛋白（部分蛋白重复）,其中在胆囊癌中上调表达的10个,包括:膜联蛋白A4,膜突蛋白,人纤维蛋白素原β链,肌凝蛋白、肌动蛋白-胞质2、放射相关性蛋白3,血清白蛋白;下调的蛋白11个:血红蛋白β亚基,肌动蛋白-大血管平滑肌,原肌凝蛋白α-1链,（肌动蛋白）凝溶胶蛋白,凝胶溶素胶原α-1（VI）链,超（过）氧化物歧化酶[铜-锌],半乳凝素-1,角蛋白II型细胞支架,（中间丝）波形蛋白,视黄醛脱氢酶1,热休克蛋白HSP-90-β。其中下调蛋白视黄醛脱氢酶1为新颖发现,未见其与肿瘤的相关报道。第二部分我们选取上调蛋白膜联蛋白A4（AnnexinA4）、膜突蛋白（Moesin）及下调蛋白视黄醛脱氢酶1Retinal dehydrogenase1、热休克蛋白90（Heat shock protein HSP 90-beta）、波形蛋白（Vimentin）经Realtime-PCR及WesternBlot验证,结果表明:膜联蛋白A4及膜突蛋白在癌组织标本中有高于对照组表达的趋势,而视黄醛脱氢酶1在对照组中的表达有高于癌组织组的趋势。由于样本量少,在这部分中我们仅能做一个趋势的判断。最后AnnexinA4、Moesin及Retinal dehydrogenase1入选进入大样本（59例）胆囊癌组织芯片免疫组化验证,结果表明:在慢性胆囊炎及癌旁组织中ALDH1A1阳性表达,而Annexin IV和Moesin呈阴性或为弱阳性表达,在59例胆囊癌组织中,ALDH1A1,Annexin IV和Moesin三者的表达率分别为62.7%（37/59）、42.4%（25/59）和35.6%（21/59）,统计结果表明慢性胆囊炎、癌旁组织、胆囊癌组织中三者表达差异有统计学意义（p<0.05）。分析三者的表达关系与胆囊癌的临床病理联系表明:Moesin阳性表达与性别（男）、浸润深度、肝脏转移以及疾病进展呈正相关,Annexin IV与淋巴结转移和疾病进展高度相关,而ALDH1A1疾病进展和组织分化呈负相关。同时三者存在着Moesin与ALDH1A1呈负相关,Moesin与Annexin IV呈正相关,而ALDH1A1与Annexin IV无相关性的表达关系。结论:我们的结果提示: Moesin和Annexin IV有可能成为胆囊癌诊断或生物治疗的新颖靶点,其中,Moesin蛋白可能与雌激素受体相关的胆囊癌又千丝万缕的关系。我们第一次发现并报道ALDH1A1蛋白在抑制胆囊癌的生长和分化中可能有重要的作用,其直接催化的产物维甲酸可能可以抑制胆囊癌细胞的生长。最后,我们首次对胆囊癌组织的差异蛋白质做出大致描绘,这些结果或许可以为了解胆囊癌的发病机理提供很好的帮助。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 参考文献
• 第一部分：胆囊癌组织蛋白质组双向凝胶电泳－质谱分析
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 分析与讨论
• 四 参考文献
• 第二部分：人胆囊癌组织差异蛋白的验证
• 一、胆囊癌相关差异蛋白的Realtime-PCR 检测
• （一） 材料与方法
• （二） 结果
• 二、胆囊癌相关差异蛋白的Western免疫印迹表达
• （一） 材料与方法
• （二） 结果
• 三、讨论
• 四、参考文献
• 第三部分：大样本人胆囊癌相关组织差异蛋白表达的研究
• 一、组织芯片的构建
• （一） 材料与方法
• 二、免疫组织化学研究
• （一） 材料与方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 参考文献
• 第四部分：全文总结暨后续研究展望
• 附录
• 综述
• 在读研究生期间发表的论文和参加科研工作情况说明
• 致谢