水分胁迫下小麦叶片类脱水素的表达与亚细胞定位的研究

论文摘要

植物在干早胁迫下会产生多种逆境响应蛋白,胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）中D-11族脱水蛋白（dehydrin）是其中之一,该蛋白富含甘氨酸和赖氨酸,具有高度亲水性,是一种热稳定蛋白,脱水蛋白含有其特殊的保守区,目前发现有3类非常保守的区域,即K、S和Y片段,其中K片段是所有脱水蛋白都具有的,从而可利用合成K-片段同源多肽的抗体来检测和定位脱水蛋白。脱水素存在于植物细胞的各个部位,一般存在于细胞核和细胞质中,在线粒体、质膜附近也有分布,不同植物组织在不同胁迫条件下（干旱、盐渍、低温等）诱导产生的脱水素在细胞内的分布各不相同。在细胞核内脱水素可存在于常染色质、异染色质、核膜和核仁中;在细胞核外主要存在于细胞质基质中,少量存在于细胞器中。本研究以抗旱性较强‘陕合6号’和抗旱性较弱‘郑引1号’小麦为试验材料,采用PEG胁迫处理小麦幼苗,利用胶体金免疫电镜技术及Westernblot方法,分析水分胁迫下小麦叶片类脱水素的表达、在亚细胞结构上的分布,结合其细胞膜相对透性和可溶性蛋白的变化,了解小麦叶片类脱水素在细胞空间的分布与其抗旱功能之间的关系。主要获得以下结论:1、水分胁迫处理初期（4～8 h）金颗粒主要分布在细胞质,细胞核中仅有少量表达,细胞膜中未见金颗粒分布;处理中期（12～24 h）金颗粒主要分布在细胞质和细胞核,细胞器和细胞膜中有零星分布;后期（36～48 h）大量金颗粒富集于细胞质膜附近;复水24 h后细胞质和细胞核中金颗粒相对增多,质膜附近相对减少。结果表明,植物受到短期干旱胁迫时脱水蛋白主要分布在细胞质中,随着胁迫时间的延长,脱水素大量聚集在质膜附近,说明不同程度干旱其脱水素在细胞中的分布不同。以叶片组织不进行胁迫处理和省却脱水蛋白抗体作阴性对照,几乎未发现金颗粒,说明脱水蛋白是在水分胁迫诱导下表达。两个品种在胁迫36 h之前细胞质金颗粒数目多于细胞核,而36 h后细胞核金颗粒数目多于细胞质,表明细胞质中的富集先于细胞核。2、Western blot显示,水分胁迫处理各时期37 kD脱水素条带在正常供水情况下未出现,但是随胁迫时间延长,该蛋白条带逐渐加深,表明此脱水蛋白表达量增加,复水之后逐渐消失。不同品系脱水蛋白表达有一定的差异,抗旱性较强陕合6号脱水蛋白表达量高于抗旱性较弱郑引1号脱水蛋白表达量,并且呈正相关,说明该脱水蛋白的表达与小麦抗旱性密切相关。3、随着胁迫程度的增加,细胞膜相对透性增大,部分电解质外渗,复水后细胞膜相对透性下降,陕合6号细胞膜相对透性下降较郑引1号小,而研究表明陕合6号脱水蛋白表达量高于郑引1号,表明脱水蛋白与植物抗旱性呈正相关。4、随干旱胁迫时间的延长,陕合6号和郑引1号的可溶性蛋白含量均呈先增加后降低,复水后又有上升的趋势,脱水素也归属于可溶性蛋白,水分胁迫下陕合6号较郑引1号的可溶性蛋白含量低,其变化趋势与脱水蛋白表达趋势相反,但是陕合6号小麦抗旱性较郑引1号强,说明脱水素在组织中稳定细胞的结构起到一定的作用,体现了植物抗旱机制的复杂性,也反应了水分胁迫诱导蛋白的特点与抗脱水能力的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 脱水蛋白研究进展
• 1.2.1 脱水蛋白的结构与分类
• 1.2.2 脱水素的定位
• 1.2.3 脱水蛋白的功能与作用机理
• 1.3 蛋白定位方法研究现状
• 1.3.1 融合报告基因定位法
• 1.3.2 免疫组织化学定位法
• 1.3.3 共分离标记酶辅助定位法
• 1.3.4 蛋白质组学定位技术
• 1.3.5 蛋白质组学定位技术
• 1.4 胶体金免疫电镜技术研究进展
• 1.4.1 胶体金免疫电镜技术的基本原理
• 1.4.2 免疫胶体金技术的发展
• 1.4.3 免疫胶体金技术的应用
• 1.4.4 免疫胶体金技术的优缺点
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究的主要内容
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 水分胁迫下小麦叶片类脱水蛋白表达的研究
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦幼苗培养处理
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蛋白定量分析
• 2.3.2 水分胁迫对陕合6 号叶片类脱水素表达的影响
• 2.3.3 水分胁迫下耐旱性不同两个小麦品系叶片类脱水素表达比较
• 2.4 讨论与小结
• 第三章 水分胁迫下小麦叶片类脱水蛋白亚细胞定位的研究
• 3.1 实验材料与试剂仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 小麦幼苗培养
• 3.2.2 电镜制样
• 3.2.3 免疫染色程序
• 3.2.4 透射电镜镜检
• 3.2.5 免疫金标记颗粒统计
• 3.2.6 数据处理
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 脱水素在陕合6 号小麦叶肉细胞中的定位
• 3.3.2 脱水素在郑引1 号小麦叶肉细胞中的定位
• 3.3.3 水分胁迫对小麦叶片类脱水素分布的影响
• 3.3.4 两个品系小麦叶片类脱水素亚细胞定位金颗粒密度比较
• 3.4 讨论与小结
• 第四章 水分胁迫下小麦叶片细胞膜透性和可溶性蛋白变化的响应
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法与试剂
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 水分胁迫对陕合6 号和郑引1 号小麦叶片细胞膜透性的影响
• 4.2.2 水分胁迫对陕合6 号和郑引1 号小麦叶片可溶性总蛋白质含量的影响
• 4.2.3 两个品系小麦叶片细胞膜相对透性和可溶性蛋白含量比较
• 4.3 讨论与小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介