辣椒根际拮抗菌筛选、鉴定及多粘类芽孢杆菌SC2拮抗相关基因克隆

论文摘要

以辣椒根腐病原菌（Fusarium solani）为指示菌,从贵州辣椒根际筛选到5株具有明显拮抗效果的细菌,编号分别为:SC2、SC2-4、SC2-4-1、SC2-4-2和SC2-4X。5个菌株抗菌谱较广,对黄瓜枯萎病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）、黄瓜霜霉病原菌（Pseudoperonospora cubensis）、芹菜灰霉病原菌（Botrytis cinerea Pers）以及西红柿灰霉病原菌（Botrytis cinerea）也具有良好的拮抗性能。经形态特征、生理生化指标和16S rDNA序列分析,将SC2、SC2-4-2、SC2-4X鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）,SC2-4、SC2-4-1鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。SC2菌株产生的抗菌物质可能为蛋白类或抗菌肽类物质。β-1, 4-木聚糖酶和β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶活性检测结果表明,P. polymyxa SC2能同时产生β-1, 4-木聚糖酶和β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶。以菌株SC2的基因组DNA为模板,通过热不对称交错PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）方法克隆到4807bp的DNA片断。DNAMAN软件分析,该DNA片断包含两个开放阅读框（open reading frames, ORF）,ORF1长度为1908 bp,编码含635个氨基酸、分子量为67.8 kDa的蛋白;ORF2长度为714 bp,编码含237个氨基酸、分子量为26.8 kDa的蛋白。BLAST分析结果表明,ORF1与已报道的P. polymyxa ATCC 842的xynD基因相似性为94%,ORF2与P. polymyxa WY110的gluB基因相似性为99%。基因序列的系统发育分析进一步说明,ORF1和ORF2分别为β-1, 4-木聚糖酶基因xynD和β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶基因gluB。用已报道的检测非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs）基因保守区的兼并引物TGD和LGG为引物,以P. polymyxa SC2的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得一段长度为497bp的NRPS基因保守区序列。采用TAIL-PCR方法,以SC2基因组DNA为模板,根据获得的NRPS基因保守区序列,分别向两侧翼设计特异性引物LNRP1、LNRP2、LNRP3和RNRP1、RNRP2、RNRP3,分别与随机引物（arbitraryprimers）建立扩增体系,扩增该已知序列的两侧序列。随后多次设计TAIL-PCR特异性引物,进行TAIL-PCR扩增。同时,根据已知的B. subtilis bamC、B. subtilis mycC、B. subtilis ituC和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42 bmyC序列,设计兼并引物,进行PCR扩增,将得到的所有序列拼接,得到长度为19040bp的DNA序列。DNAMAN软件分析发现,该DNA序列包含一个5’-末端不完整的17502bp ORF。BLAST分析结果表明,该ORF与P. polymyxa E681 fusA的6214-23727bp序列相似性为90%,其推测的氨基酸序列相似性为92%。对P. polymyxa SC2的FusA的5333个氨基酸的多肽片断进行结构域分析,结果表明,该多肽片断包含四个模块,分别为C-A-T、C-A-T-E、C-A-T-E和C-A-T;四个模块的A结构域可能识别的特异性氨基酸底物分别为L-Tyr、D-Thr、D-Asn和Ala,与fusaricidin C的后四个氨基酸残基组成和顺序一致。P. polymyxa SC2的FusA片断的四个A结构域的氨基酸序列与P. polymyxa E681的FusA的A3、A4、A5和? A6结构域的相似性分别为86%、94%?、98%和96%;其对应的核苷酸序列相似性分别为85%、89%、94%和92%。推测,菌株P. polymyxa SC2 fusA序列可能是非核糖体合成肽fusaricidin C生物合成的关键基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物根际促生细菌
• 1.2 拮抗细菌
• 1.2.1 种类
• 1.2.2 主要作用机制
• 1.2.3 产生的抗菌物质
• 1.2.4 拮抗细菌在植物病害防治中的优势
• 1.2.5 拮抗细菌在植物病害防治中的主要应用途径
• 1.2.6 细菌作为生防因子存在的问题及相关对策
• 1.3 芽孢杆菌非核糖体肽类抗生素的合成
• 1.3.1 一般合成过程
• 1.3.2 脂肽抗生素合成过程
• 1.4 具有生防作用的多粘类芽孢杆菌
• 1.4.1 产生的抗菌物质
• 1.4.2 拮抗分子机制
• 1.5 本研究的目的意义
• 1.6 研究内容、技术路线及方法
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 1.6.3 研究方法
• 第二章 辣椒根际根腐病拮抗菌的筛选及鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 根际样品与病原菌
• 2.2.2 培养基与培养液
• 2.2.3 主要药品、试剂
• 2.2.4 主要仪器设备
• 2.2.5 细菌的分离
• 2.2.6 拮抗菌的筛选及抗菌谱测定
• 2.2.7 拮抗菌的鉴定
• 2.2.8 基因组DNA 的提取
• 2.2.9 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.10 DNA 浓度的确定
• 2.2.11 16S rDNA 的PCR 扩增
• 2.2.12 产物的纯化
• 2.2.13 DNA 序列测定
• 2.2.14 抑菌机理初步研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 拮抗菌的筛选及抗菌谱测定
• 2.3.2 拮抗菌的鉴定
• 2.3.3 SC2 菌株抑菌机理初步研究
• 2.4 讨论
• 第三章 P. polymyxa SC2 gluB 和xynD 的克隆及序列分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基及主要试剂
• 3.2.3 β-1, 4-木聚糖酶和β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶活性检测
• 3.2.4 细菌基因组DNA 的提取
• 3.2.5 gluB 保守区域的克隆
• 3.2.6 DNA 凝胶回收
• 3.2.7 DNA 浓度的确定
• 2 法）'>3.2.8 DH5α感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 3.2.9 PCR 产物克隆
• 3.2.10 重组质粒的筛选与鉴定
• 3.2.11 序列测定
• 3.2.12 TAIL-PCR
• 3.2.13 DNA 序列分析和系统发育分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 β-1, 4-木聚糖酶和β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶活性检测
• 3.3.2 gluB 保守区域的克隆
• 3.3.3 xynD 和gluB 基因簇的克隆
• 3.3.4 xynD 和gluB 基因簇序列分析
• 3.3.5 xynD 和gluB 的系统发育分析
• 3.4 讨论
• 第四章 P. polymyxa SC2 fusA 部分序列克隆及序列分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 培养基及试剂
• 4.2.2 NRPS 基因保守区克隆和序列测定
• 4.2.3 NRPS 基因保守区侧翼序列的克隆
• 4.2.4 DNA 序列分析
• 4.2.5 结构域预测
• 4.3 结果
• 4.3.1 P. polymyxa SC2 的NRPS 基因保守区克隆
• 4.3.2 NRPS 基因保守区侧翼序列的克隆
• 4.3.3 NRPS 基因片断序列分析和结构域预测
• 4.4 讨论
• 第五章 P. polymyxa SC2 两个NRPSs 基因片断的克隆
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 培养基及试剂
• 5.2.2 TAIL-PCR
• 5.2.3 NRPS 基因片断的克隆
• 5.2.4 DNA 序列分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 NRPS 基因片断的克隆
• 5.3.2 DNA 序列分析
• 5.4 讨论
• 第六章 结论及建议
• 6.1 结论
• 6.2 尚待完成的工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况