论文摘要
目的：运用逆转录病毒作为载体，将端粒酶抑制基因导入胰腺癌细胞Can-pan-2，研究其对胰腺癌细胞生长的抑制作用，为胰腺癌的基因治疗提供新途径。方法：用逆转录病毒载体pLXSN构建真核表达重组质粒pLXSN-hTR，以期重组质粒表达反义端粒酶RNA，通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞，G418筛选抗性细胞，获取稳定表达病毒的产病毒细胞株，收集细胞上清液，浓缩得到重组逆转录病毒，用NIH3T3细胞测定病毒滴度，以浓缩后的病毒上清感染Can-pan-2细胞，G418筛选获得稳定转染细胞克隆并扩增培养，PCR检测目的基因的插入，端粒酶反义RNA组分整合入胰腺癌细胞基因组中，通过其在细胞内的表达而抑制胰腺癌细胞端粒酶活性，从而抑制胰腺癌细胞的生长，并促进癌细胞的凋亡。本实验通过TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，免疫荧光化学法检测不同处理组细胞的增殖情况，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况。结果：两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106CFU／ml和1.1×106CFU／ml，反义端粒酶RNA基因转染胰腺癌细胞Can-pan-2，PCR检测转染成功，TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，Can-pan-2-hTR-BamHI细胞端粒酶活性为0.67±0.07，较Can-pan-2-hTR-EcoRI（1.00±0.17）和Can-pan-2（1.14±0.27）明显降低；免疫荧光化学法示Can-pan-2及Can-pan-2-hTR-EcoRI细胞的PCNA平均荧光灰度值分别为26.92±0.57和26.20±0.77，显著高于Can-pan-2-hTR-BamHI细胞的18.37±0.91；流式细胞仪示Can-pan-2-hTR-BamHI细胞凋亡率为9.7％，显著高于Can-pan-2（7.2％）及Can-pan-2-hTR-EcoRI细胞（6.9％）。结论：端粒酶反义RNA组分经逆转录病毒载体导入胰腺癌细胞，可整合入胰腺癌细胞端粒酶基因中，导致端粒酶基因表达异常，肿瘤细胞端粒缩短，导致细胞凋亡，胰腺癌细胞生长受到抑制，为携带端粒酶抑制基因的重组逆转录病毒载体在体内感染胰腺癌细胞提供可靠的理论依据，有望成为胰腺癌基因治疗的一种新方法。