辣椒疫霉（Phytophthora capsici）5个果胶甲基酯酶基因克隆及pcpme1的功能研究

论文摘要

辣椒疫病是一种世界性土传病害,严重影响我国及世界各国的辣椒生产,造成巨大的经济损失,该病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）引起。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤及病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,感病品种的重复种植能够导致卵孢子在土壤中大量积累。该菌可以在任何生长季节侵染寄主植物引起种苗死亡、茎腐、枯萎、果实腐烂;寄主范围广,可以侵染辣椒、西葫芦、黄瓜、茄子番茄等9科20多种作物。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用轮作、化学防治和培育抗病品种。但是农药残留容易对环境造成污染;辣椒疫霉生理小种的变化造成抗病品种效果不稳定。因此,寻找探索辣椒疫霉菌重要的致病因素来控制病害已经成为科学家研究的热点。研究表明植物病原菌与寄主互作过程中分泌的果胶酶是重要的致病酶,这些酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶,它们产生于病原菌识别、定殖及与寄主建立寄生关系的过程中,降解或软化细胞壁的果胶、中胶层乃至破坏寄主的防御体系,增强病原菌对寄主的亲合力。因此,植物病原菌在侵染寄主过程中所分泌的细胞壁降解酶是一类重要的致病因子,其活性高低是界定植物病原菌侵染与否或致病力强弱的重要技术指标之一。其中,果胶甲基酯酶（PME）是许多植物病原菌的致病因子,在植物发病过程中起重要作用。本研究以辣椒疫霉为研究对象,筛选多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶活性较高的辣椒疫霉菌株,并构建了其基因组DNA文库,应用Pool PCR方法分离和克隆了5个pme基因。构建了pcpme1基因真核表达载体,通过诱导表达获得重组蛋白,用Anti-His抗体通过Western Blot检测了其表达情况,用Ni-NTA树脂纯化了表达的PCPME1,并制备了特异性抗体,用Western Blot检测了pcpme1在辣椒体内的表达情况;用PNGase F对PCPME1进行去糖基化处理,研究了糖基化位点对其活性的影响;找到pcpme1的活性中心位点,对其进行定点突变,然后进行真核表达,获得纯蛋白;应用RT-PCR和Northern Blot方法分析了其在辣椒体内的表达情况;用表达的原始PCPME1、去糖基化的蛋白,定点突变后的蛋白分别接种辣椒叶片,透射电镜观察其对寄主细胞壁的破坏作用。主要研究内容如下:采用分光光度法测定辣椒疫霉菌SDPH-33的多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶裂解酶的活性;滴定法测定了果胶甲基酯酶活性;结果发现,辣椒疫霉的致病性与其PGs、PELs、PMEs的活性密切相关。利用Pool PCR法筛选SDPH-33的基因组文库,从文库中共分离克隆了5个pme基因,并对其结构特征进行分析。对其序列和蛋白结构进行分析发现, 5个pme基因具有很高的同源性,所编码的蛋白具果胶甲基酯酶的保守序列和活性位点（GxYxE、QDTL、QAVAL、DFIFG和LGRPW）,并具有不同数目的糖基化位点,其蛋白结构也具明显的相似性。根据比对不同来源的PME的氨基酸系列构建的进化树表明,辣椒疫霉的pme基因与卵菌的pme基因聚在一起,亲缘关系最近,明确了卵菌在自然界中的分类地位。用SDPH-33的游动孢子悬浮液接种4-6叶期辣椒叶片,提取发病叶片的总RNA,合成cDNA。根据pcpme的序列设计特异性引物,RT-PCR检测接种叶片内pcpme的表达情况。结果发现,接种后pcpme在发病辣椒体内均能表达,其表达量随着时间延长而加强,第7天表达量最高,而在健康辣椒组织中则没有发现任何pcpme的表达。结合RT-PCR的结果及基因的糖基化位点数目确定pcpme1为关键的致病基因,根据pcpme1的序列设计引物,PCR扩增片段以制备探针,Northern Blot结果表明,pcpme1基因在接种辣椒叶片内得到表达,结果于RT-PCR相似。根据已经克隆的pcpme1基因的序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建成重组表达载体pPIC9K-pcpme1,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经过G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,目的蛋白分子量约为60KDa,比预期蛋白的分子量大,用anti-his抗体检测到pcpme1已经在毕赤酵母中获得了高效表达。通过Ni-NTA树胶纯化系统并透析后获得了表达的PCPME1融合蛋白,发现其对提取的辣椒细胞壁具有降解活性,通过将纯化的PCPME1蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western Blot分析结果表明,pcpme1基因在发病的辣椒组织中获得了充分的表达,且随着发病程度的提高表达量逐渐增高。将纯化的PCPME1蛋白用PNGase F处理,获得了去糖基化的蛋白,分子量约为37Kda与预期蛋白的分子量相当,根据去糖基化前后蛋白的活性测定确定了糖基化对PMEs的活性不起决定性作用。根据前人报道的结果预测PCPME1的活性位点,并对其进行定点突变,将突变后的基因转化毕赤酵母,并诱导其表达,用Ni-NTA树胶纯化系统并通过透析获得了突变后的蛋白,突变前后蛋白的活性测定结果表明突变的氨基酸为该蛋白的活性位点。用纯化的野蛋白PCPME1、去糖基化的蛋白、突变后的蛋白分别接种4-6叶期的辣椒幼苗叶片,发现野蛋白和去糖基化的蛋白能够在叶片上引起病斑,且病斑的大小随接种时间的延长而增大;突变后的蛋白接种后则不能形成病斑;接种无菌水的对照叶片也没有表现症状。将接种后的辣椒用透射电镜观察其细胞壁的结构发现接种野蛋白和去糖基化的蛋白细胞壁被不同程度地降解,而接种突变蛋白和无菌水的辣椒其细胞壁基本保持完整。本实验的结果表明pcpme1是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因家族中起致病作用的关键基因之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1 辣椒疫病的研究进展
• 1.1 辣椒疫病的发生危害情况
• 1.2 辣椒疫病发生规律和发病条件
• 1.3 辣椒疫霉及其生物学特性
• 1.4 辣椒疫霉的生理分化
• 1.5 辣椒疫病的防治
• 1.5.1 农业防治
• 1.5.2 化学防治
• 1.5.3 生物防治
• 2 植物病原真菌致病基因的研究进展
• 2.1 与侵染结构产生有关的基因
• 2.2 与细胞壁降解有关的基因
• 2.3 与寄主代谢反应产物有关的基因
• 2.4 毒素基因
• 2.5 与信号传导有关的基因
• 2.6 其它功能的致病基因
• 3 植物病原菌细胞壁降解酶的研究现状
• 3.1 细胞壁降解酶的分类
• 3.2 植物细胞壁降解酶的抑制子
• 4 果胶酶的研究进展
• 4.1 果胶酶的分类
• 4.1.1 原果胶酶（protopectinases）
• 4.1.2 多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases）
• 4.1.3 果胶裂解酶（pectate lyases）
• 4.1.4 果胶甲基酯酶（ Pectin methylesterases）
• 4.2 果胶酶在致病过程中的作用
• 4.3 微生物果胶酶基因
• 4.4 果胶酶活力的检测方法
• 4.4.1 滴定法
• 4.4.2 黏度下降法
• 4.4.3 脱胶作用时间法
• 4.4.4 还原糖测定法
• 4.4.5 235nm 处紫外吸收测定法
• 5 果胶甲基酯酶的研究进展
• 5.1 果胶甲基酯酶的存在与来源
• 5.2 果胶甲基酯酶的基本生物学特征
• 5.2.1 果胶甲基酯酶的分子量及分子组成
• 5.2.2 果胶甲基酯酶的初级结构
• 5.2.3 果胶甲基酯酶的三级结构
• 5.3 果胶甲基酯酶的性质与作用机理
• 5.4 果胶甲基酯酶的活性
• 5.4.1 果胶甲基酯酶活性的调节
• 5.4.2 果胶甲基酯酶活性测定方法与分析
• 5.5 植物中果胶甲基酯酶的研究进展
• 5.5.1 植物果胶甲基酯酶特性
• 5.5.2 果胶甲基酯酶在植物发育过程中的功能
• 5.5.3 植物果胶甲基酯酶的基因克隆
• 5.6 果胶甲基酯酶在植物病原菌中的研究
• 5.6.1 果胶甲基酯酶在植物病原细菌中的研究
• 5.6.2 果胶甲基酯酶在植物病原卵菌及真菌中的研究
• 5.6.3 果胶甲基酯酶突变体的研究
• 5.7 果胶甲基酯酶异源表达的研究
• 6 蛋白糖基化的研究进展
• 6.1 糖基化位点的功能
• 6.2 糖基化位点的识别方法
• 6.3 糖基化蛋白的去糖基化
• 6.3.1 外切型糖苷酶（Exo- glycosidase）
• 6.3.2 内切型糖苷酶（Endo- glycosidase）
• 6.3.3 糖胺酶（Glycoam idase, N - 糖苷酶）
• 7 利用酵母体系表达异源蛋白的研究进展
• 7.1 酵母表达体系的优点
• 7.2 毕赤酵母表达体系
• 7.2.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性
• 7.2.2 毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型
• 7.2.3 表达载体在毕赤酵母中的整合
• 7.2.4 巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程
• 8 重组蛋白纯化的研究进展
• 8.1 多聚精氨酸一标签（Arg-tag）
• 8.2 多聚组氨酸一标签（His-tag）
• 8.3 FLAG-标签
• 8.4 谷胱甘肽S-转移酶标签
• 8.5 s-标签
• 8.6 SBP-标签
• 选题目的及意义
• 第二章 强致病辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶活性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 辣椒疫霉菌果胶酶粗酶液的提取
• 1.2.2 多聚半乳糖醛酸酶的活性测定
• 1.2.3 果胶甲基酯酶的活性测定
• 1.2.4 果胶裂解酶的活性测定
• 1.2.5 粗酶液接种辣椒发病
• 2 结果与分析
• 2.1 强致病辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶活性比较
• 2.2 强致病辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶活性比较
• 2.3 强致病辣椒疫霉菌果胶裂解酶活性比较
• 2.4 粗酶液接种辣椒后发病面积比较
• 3 讨论
• 第三章 辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 溶液配制
• 1.1.7 引物设计
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 96 个克隆总质粒DNA 的大量提取（碱裂解法）
• 1.2.2 16 个克隆总质粒DNA 的提取
• 1.2.3 单个克隆质粒DNA 的提取
• 1.2.4 Pool PCR 法筛选基因组文库
• 1.2.5 全长序列基因的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME1 基因的克隆及其序列分析
• 2.1.1 pcpme1 基因的克隆
• 2.1.2 pcpme1 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.1.3 PCPME1 的氨基酸组成
• 2.1.4 PCPME1 的二级结构预测
• 2.2 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME2 基因的序列及结构分析
• 2.2.1 pcpme2 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.2.2 PCPME2 的氨基酸组成
• 2.2.3 PCPME2 的二级结构预测
• 2.3 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME3 基因的序列及结构分析
• 2.3.1 pcpme3 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.3.2 PCPME3 的氨基酸组成
• 2.3.3 PCPME3 的二级结构预测
• 2.4 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME4 基因的序列及结构分析
• 2.4.1 pcpme4 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.4.2 PCPME4 的氨基酸组成
• 2.4.3 PCPME4 的二级结构预测
• 2.5 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME5 基因的序列及结构分析
• 2.5.1 pcpme5 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.5.2 PCPME4 的氨基酸组成
• 2.5.3 PCPME5 的二级结构预测
• 2.6 辣椒疫霉5 个果胶甲基酯酶基因的比较
• 2.7 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因在自然界中的进化分析
• 3 讨论
• 3.1 辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因的序列特征
• 3.2 辣椒疫霉果胶甲基酯酶酶基因家族的生物学意义
• 3.3 辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因与其它 PMEs 的关系
• 第四章 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因在寄主体内的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 接种辣椒叶片
• 1.2.2 受试辣椒叶片总RNA 的提取和cDNA 的合成
• 1.2.3 RT-PCR
• 1.2.4 Northern Blot
• 1.2.5 Western Blot 检测pcpme1 在辣椒寄主内的表达情况
• 2 结果与分析
• 2.1 RT-PCR 扩增结果
• 2.2 Northern Blot 分析
• 2.2.1 探针的制备
• 2.2.2 Northern Blot 分析
• 2.2.3 Western Blot 检测
• 3 讨论
• 第五章 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶 pcpme1 基因的体外表达、纯化及其活性位点的定点突变
• 1 pcpme1 基因的体外表达、纯化
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 果胶甲基酯酶基因pcpme1 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 果胶甲基酯酶基因在毕赤酵母中的表达
• 1.2.3 果胶甲基酯酶融合蛋白的纯化及活性测定
• 1.2.4 纯化PCPME1 的去糖基化
• 1.2.5 特异性抗血清的制备
• 2 pcpme1 基因活性位点的定点突变
• 2.1 试剂材料
• 2.2 pcpme1 基因活性位点的确定
• 2.3 定点突变
• 3 结果与分析
• 3.1 果胶甲基酯酶基因 pcpme1 在毕赤酵母中的表达
• 3.1.1 pcpme1 成熟肽基因序列的分离
• 3.1.2 酵母表达载体的构建和鉴定
• 3.1.3 重组表达载体pPIC9K/pcpme1 转化 Pichia pastaris GS115 及酵母转化子的筛选
• 3.2 PCPME1 融合蛋白的纯化及活性测定
• 3.3 纯化蛋白的去糖基化
• 3.3.1 去糖基化PCPME1 的SDS-PAGE 分析
• 3.3.2 去糖基化PCPME1 的活性测定
• 3.4 兔抗血清的制备
• 3.5 pcpme1 的定点突变
• 3.5.1 突变后基因序列分析
• 3.5.2 突变后表达蛋白的纯化
• 3.5.3 突变后蛋白的活性测定
• 4 讨论
• 4.1 表达系统的选择
• 4.2 外源基因在 Pichia pastoris 中的分泌表达的必要性
• 4.3 影响外源基因表达量的因素
• 第六章 辣椒疫霉果胶甲基酯酶PCPME1 及其突变体对辣椒细胞壁的降解
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 辣椒幼苗叶片的接种
• 1.2.2 透射电镜观察
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 结论与建议
• 1 结论
• 2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况