论文摘要
目的:树突状细胞（dendritic cell, DC）作为唯一的专职抗原递呈细胞（antigen processing cell, APC）,处于免疫反应的中心地位。非成熟的DC捕获抗原后被激活为成熟的DC,其分子表面表达MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子B7-1（CD80）及B7-2（CD86）、黏附分子CD54（ICAM-1）及CD50（ICAM-3）等,并将抗原肽递呈给CD4+和CD8+T细胞,诱导其成为特异性细胞毒性T细胞（CTL）,诱导CD4+T细胞分泌细胞因子,产生Th1型免疫应答而发挥抗肿瘤作用。本实验从乳腺癌患者腋窝引流淋巴结中分离单个核细胞,用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导成为DC,再以自体乳腺癌细胞冻融抗原负载DC,刺激从腋下引流淋巴结中分离、并以rhIL-2诱导培养的肿瘤区域引流淋巴结细胞（TDLNC）,使之成为具有针对靶细胞特异杀伤活性的CTL,并检测其在体外针对自体乳腺癌细胞及MCF-7细胞的杀伤效应,分析分化诱导的DC的功能和CTL的杀伤特异性,以期建立一种乳腺癌个体化的治疗方法。方法:1.严格无菌摘取淋巴结1-2枚,用机械法获取淋巴细胞悬液,并用淋巴细胞分离液分离出其中间白膜层单个核细胞,以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬、培养。2 .贴壁2h ,贴壁细胞以rhGM-CSF （ 1000u/ml ） ,rhIL-4（200u/ml）和TNF-α（200u/ml）联合培养诱导DC;非贴壁细胞,加入rhIL-2（200u/ml）培养为TDLNC。3.用酶消化法自乳腺癌组织块中制备自体乳腺癌细胞,并用自体乳腺癌细胞冻融抗原负载DC,后者和TDLNC共培养,以诱导抗原特异性CTL。4.分别于第1天和第7天收获DC,加入PE-CD1a、PE-CD83、FITC-CD86单克隆抗体,用流式细胞分析仪检测细胞表型。于第7天和第10天收获TDLNC,分别加入FITC-CD3单克隆抗体,FITC-CD4/PE-CD8二联抗体,检测其细胞表型。5.用非放射性细胞毒分析试剂盒,测定各组不同方法诱导的CTL细胞对自体乳腺癌细胞和MCF-7细胞的杀伤活性,从而分析分化诱导的DC的功能和CTL的杀伤特异性。结果:1.乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养后,可以形成具有成熟DC形态特点的细胞。2.DC特异性表面标志物CD1a、CD83、CD86诱导前百分含量分别为:10.98±2.38、26.55±5.24、32.96±6.09,经与rhGM-CSF、rhIL-4共同培养,自体肿瘤冻融抗原加TNF-α诱导后为50.17±5.68、60.48±16.46、56.22±16.38, P<0.01。3.诱导前TDLNC中CD3+、CD8+细胞含量分别为:73.93±2.18、32.78±3.21;诱导后DC-Ag-TDLNC组的CD3+、CD8+细胞含量分别为:82.67±2.79、62.54±2.51。DC诱导后CD3+、CD8+T细胞含量均升高, P<0.01。诱导前CD4+细胞含量为27.3±2.58 ;诱导后DC-Ag-TDLNC组的CD4+细胞含量为17.49±4.21;DC-TDLNC组为19.49±2.12。三组细胞相比较,诱导后CD4+细胞含量无明显升高,P>0.05。4.DC-Ag-TDLNC组对自体乳腺癌细胞的杀伤率为67.64%;DC-TDLNC组和TDLNC对自体乳腺癌细胞的杀伤率分别为31.25%、26.36%。统计结果表明,DC-Ag-TDLNC组对自体乳腺癌细胞的杀伤率明显增高,三组间比较p<0.001; DC-TDLNC和TDLNC组间比较P<0.05。三组细胞对MCF-7细胞的杀伤率无明显差异（P>0.05）。结论:1.乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞,在rhGM-CSF、rhIL-4刺激活化和自体乳腺癌细胞冻融抗原及TNF-α的诱导下,可以诱导培养出具有典型细胞学形态特征的成熟DC。2.成熟的DC表面高表达其特异性表面标志物,并具有较强的抗原提呈功能,可以促进TDLNC增殖、分化为具有高度杀伤效应性的CTL。3.经自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激诱导的DC可以使TDLNC增殖、分化为肿瘤抗原特异性CTL,针对自体乳腺癌细胞具有较高的杀伤效应,而对其他类型的肿瘤细胞不具有特异性杀伤效应。4.未经自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激诱导的DC虽也可以使TDLNC增殖、分化为CTL,但此CTL不具有针对自体乳腺癌细胞的特异性杀伤效应,其对自体乳腺癌细胞的杀伤活性与以rhIL-2培养的TDLNC相同。5.从乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞以细胞因子与自体乳腺癌细胞冻融抗原联合刺激诱导DC,并激发TDLNC成为肿瘤特异性杀伤作用的CTL,用以杀伤自体乳腺癌细胞是一种可行的方法。
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