论文摘要
利用植物生产重组药用蛋白,即植物生物反应器或分子药业,是近年来植物基因工程的研究热点之一。目前已经开发出多种生产重组蛋白的植物表达系统,其中油体蛋白表达系统通过利用植物油体蛋白（Oleosin）作为重组蛋白的“载体”,将重组蛋白定位至油料植物种子等器官的油体（oil body）上从而实现重组蛋白的高效表达,该系统因具有重组蛋白表达量高、纯化方便等优点而极具应用前景。本文利用该系统在拟南芥中进行了表达鲑鱼降钙素（salmon calcitonin,sCT）.大鼠酰胺化酶（α-amidating enzyme,α-AE）和人胰岛素样生长因子I（human insulin-like growth factor I,hIGF-I）的研究,取得了一定进展。sCT是长度为32个氨基酸、N-端含有一对二硫键、C-端为脯氨酰胺结构的多肽激素,其主要作用是抑制骨的溶解,在骨质疏松症、Paget’s骨病等与骨代谢有关的疾病的临床治疗中起着非常重要的作用。本文根据天然鲑鱼降钙素sCT和活性更高的突变型鲑鱼降钙素msCT（[Gly8,Ala16,des-Tyr22]sCT）的酰胺化酶作用前体sCTgly和msCTgly的氨基酸序列,按照植物偏爱密码子优化设计了sCTgly和msCTgly基因,将sCTgly基因与大豆24 kDa油体蛋白基因的3’端融合后置于烟草花叶病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV）的35S启动子下,将所构建的载体转化拟南芥,发现融合蛋白主要在转基因拟南芥种子中积累并正确定位至油体上。将msCTgly基因与油菜20 kDa油体蛋白基因3’端融合后置于油菜油体蛋白启动子下,将所构建的载体转化拟南芥,发现融合蛋白在拟南芥种子中特异表达,Oleosin-msCTgly融合蛋白表达量达到种子总蛋白（total seed protein,TSP）的1.32%。通过“悬浮-离心”的方法纯化到融合蛋白并用凝血酶（Thrombin）将msCTgly从融合蛋白中释放出来,进一步用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）纯化获得了msCTgly蛋白。msCTgly的表达量为种子总蛋白的0.17%,在已有报道植物中表达sCT的基础上提高了8倍。质谱分析发现,拟南芥种子中表达的msCTgly为末酰胺化的形式。C-端酰胺化结构为降钙素活性所必需,为了直接从植物中得到经酰胺化修饰的鲑鱼降钙素,本研究将大鼠酰胺化酶基因转入拟南芥,将获得的表达酰胺化酶的拟南芥与表达降钙素的拟南芥进行杂交和筛选,得到了降钙素和酰胺化酶共表达的植株,为进一步研究植物表达降钙素的体内酰胺化打下了基础。同时,酰胺化酶也被构建到油体蛋白表达系统中,所表达的酰胺化酶通过油体蛋白结合在油体上,可以作为固定化酶使用,为降钙素等基因工程产物的体外酰胺化提供了一条新的途径。胰岛素样生长因子I（hIGF-Ⅰ）也是一类重要的药用蛋白,本研究分别用大肠杆菌和拟南芥表达和纯化了hIGF-Ⅰ。大肠杆菌中表达的带多聚组氨酸（6×His）标签的hIGF-Ⅰ表达量为菌体总蛋白的9.6%,其中50%以可溶的形式存在,50%位于包涵体中。拟南芥中表达的hIGF-Ⅰ被置于拟南芥18.5 kDa油体蛋白的C-端,在拟南芥18.5 kDa油体蛋白启动子的驱动下积累于种子中,Oleosin-hIGF-Ⅰ融合蛋白表达量达到种子总蛋白的1%。经烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）蛋白酶切割后,hIGF-Ⅰ从融合蛋白中释放出来,表达量为种子总蛋白的0.23%,在已有植物中表达hIGF-Ⅰ的基础上提高了7倍。
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标签：拟南芥论文; 重组蛋白论文; 油体蛋白表达系统论文; 油体蛋白论文; 鲑鱼降钙素论文; 酰胺化酶论文; 胰岛素样生长因子论文;