拟南芥（Arabidopsis thaliana）受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究

论文摘要

植物因其不可运动性导致不能主动躲避逆境去寻求理想的生存环境。因此,根据环境的变化来调整生理生化途径甚至发育方向是植物体得以生存的主要手段和特征。在基因层面上,表现为植物的许多抗逆基因的表达属于诱导调控类型：当受到某一环境因素的胁迫时,植物会启动这些胁迫相关基因的表达,胁迫消失时这些基因就会关闭。然而,我们对植物体内这种诱导表达基因的知识仍然非常有限。能够用于植物基因工程的植物启动子,特别是植物来源的可诱导启动子很少。本研究课题目的是希望从植物中筛选、分离受胁迫因子诱导激活的启动子,研究分析其调控特性,鉴定它们的特异性元件。并希望能将各种特异性元件组装起来形成一种能定时、定量和定点驱动目的基因表达的新型诱导型启动子,以满足植物学基础研究和基因工程的实际应用需求。我们认为这种胁迫诱导型的启动子在植物基因工程中应当具有广泛的潜在用途。主要实验结果如下：1.本研究课题中,我们采用了一种新型的分子生物学差异显示方法从筛选拟南芥（Arabidopsis thaliana）受Cd2+诱导表达的基因着手,总共分离得到了19条差异表达转录产物。通过DNA分子测序,发现它们代表着18个基因。其中6个基因的胁迫诱导表达特性通过RT-PCR的方法进一步得到了确认。这6个基因显著地受到Cd2+诱导表达。这6个基因包括LEA（胚胎发育晚期丰富蛋白）,AtGSTF2（谷胱甘肽-S-转移酶2）, AtGsTF6（谷胱甘肽-S-转移酶6）,AtHsp70（热激蛋白70）,AtsHsp17.6-C1（17.6 kDa类型1小分子热激蛋白）和AtsHsp17.6-C2（17.6 kDa类型2小分子热激蛋白）。这些基因的获得为我们进一步深入研究植物耐受Cd2+胁迫机制提供了基础。2.在上述6个基因当中,3个Cd2+诱导表达的热激蛋白基因AtHsp70. AtsHsp17.6-C1和AtsHsp17.6-C2,在未受胁迫的营养组织中表达量很低,但在Cd2+胁迫下,基因表达量迅速提高9-16倍以上。除Cd2+之外,其它一些重金属,如Ni+、Pb2+、Cu2+、Zn2+和Al3+也能诱导这3个热激蛋白基因的表达。氧化胁迫、高温胁迫和渗透胁迫均能诱导这3个热激蛋白基因表达,说明这些基因可能参与着多种抗逆境途径。它们的启动子可能是一类多胁迫响应的启动子。实验结果表明,过量表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-C1能够有效提高植物对6μMCd2+胁迫、0.4% NaCl胁迫的耐逆性和基础耐热性,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。3.利用小分子热激蛋白基因AtHsp17.6-C2与GUS基因融合的热诱导表达系统,在拟南芥最适生长温度（22℃）下,植物的营养组织中基本上检测不到GUS酶活性。当温度升高到34-37℃时,GUS基因表达水平迅速提高。实验结果表明,37℃是该系统的最适诱导温度。这个温度也是常用的植物热驯化温度,使用这个温度短时间内处理植物将不会造成伤害。在34-37℃温度范围和0-2小时处理时间范围内,GUS酶活性随着温度的升高和热激时间的延长而提高,具有明显的剂量效应关系。据此,我们可以通过控制热激处理温度和时间来控制AtHsp17.6-C2启动子的诱导活性。我们对转基因植物⊿F1-22-13经一次热激处理后,随着恢复培养过程（22℃下）的进行,GUS酶活性在5小时时达到最高,然后开始下降；但24小时后仍然达到最高活性的73%。多次热诱导处理（37℃下处理60分钟）能够重复有效地激活AtHsp17.6-C2启动子,并且对植物生长没有明显副作用。因此,可以通过重复多次热诱导处理来获得相对稳定的基因表达。本论文主要创新点：1.我们利用一种新型的基于ACP （annealing control primer）技术的分子生物学差异显示方法建立了鉴别筛选植物体中差异表达的基因的实验平台。这样一个实验平台建立,为研究植物基因的功能,基因调控以及植物基因的实际应用开创了一条快速有效的新途径。2.证明过量表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-C1能够有效提高植物对某些胁迫的耐逆性。3.构建了一个高效的可调控的植物基因热诱导表达系统。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一部文 献综述
• 1 启动子概述
• 2+胁迫反应的分子机制'>2 植物对Cd²⁺胁迫反应的分子机制
• 2.1 镉（Cd）对植物的毒害作用
• 2.2 植物的抗镉胁迫机制
• 3. 植物热激蛋白的种类和功能
• 3.1 热激蛋白的分类
• 3.2 植物热激蛋白的功能
• 4. 植物热激蛋白启动子
• 4.1 植物热激蛋白基因启动子结构特征
• 4.2 植物热激蛋白基因的表达调控
• 4.3 植物热激蛋白启动子在基因工程中的应用
• 5 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究论文
• 2+诱导表达基因的筛选'>第一章 拟南芥受Cd²⁺诱导表达基因的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与胁迫处理方法
• 1.2 总RNA提取
• 1.3 RNA样品中DNA的去除
• 1.4 基于ACP的差异显示
• 1.5 琼脂糖凝胶中核酸片段回收
• 1.6 DNA片段的克隆
• 1.7 质粒提取
• 1.8 测序分析
• 1.9 半定量RT-PCR分析
• 2 结果
• 2+诱导表达基因的筛选'>2.1 拟南芥受Cd²⁺诱导表达基因的筛选
• 2.2 cDNA克隆的鉴定
• 2.3 半定量RT-PCR分析结果
• 3 讨论
• 第二章 AtHsp70、AtsHsp17.6-C1和AtsHsp17.6-C2基因在非生物胁迫下的表达及其抗逆功能探索
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与胁迫处理方法
• 1.2 半定量RT-PCR分析
• 1.3 植物表达载体的构建
• 1.4 植物表达载体转化农杆菌
• 1.5 转基因植株的获得
• 1.6 转基因植物的胁迫抗性实验
• 2 结果
• 2+诱导AtHsp70、AtsHsp17.6-C1和AtsHsp17.6-C2的表达'>2.1 Cd²⁺诱导AtHsp70、AtsHsp17.6-C1和AtsHsp17.6-C2的表达
• 2.2 其它重金属离子对AtHsp70、AtsHsp17.6-C1和AtsHsp17.6-C2的诱导表达
• 2.3 其它非生物胁迫下AtHsp70、AtsHsp17B-C1和AtsHsp17.6-C2的表达谱
• 2.4 转基因植物抗性分析
• 3 讨论
• 第三章 AtsHsp17.6-C2启动子的克隆及其植物诱导表达系统的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 植物表达载体构建
• 1.2 农杆菌的转化
• 1.3 转基因植株的获得
• 1.4 转基因植株的鉴定
• 1.5 GUS的组织化学染色
• 1.6 GUS活性的定量测定
• 2 结果
• 2.1 AtHsp17.6-C2::GUS构建策略
• 2.2 拟南芥的转化
• 2.3 转基因植株的鉴定
• 2.4 多种胁迫因子对AtHsp17.6-C2启动子诱导激活效应
• 2.5 AtsHsp17.6-C2启动子最适热诱导温度
• 2.6 热激处理后启动子AtHsp17.6-C2驱动基因的表达模式
• 2.7 植物诱导表达系统的最适热激诱导时间
• 2.8 多次热激处理对AtHsp17.6-C2启动子驱动的基因的表达的影响
• 3 讨论
• 总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间已发表和待发表的论文
• 致谢