狂犬病病毒糖/核融合基因DNA疫苗的研究

论文摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV）引起的人畜共患的烈性传染病，死亡率几乎是100％，免疫预防是防治狂犬病的有效途径。糖蛋白和核蛋白是RV可诱导机体产生保护性免疫反应的两种主要蛋白质。为了研制高效、安全的狂犬病疫苗，本试验通过基因工程方法将编码糖蛋白和核蛋白的狂犬病病毒基因进行融合，构建了狂犬病糖／核蛋白融合基因核酸疫苗。为了检测所构建的DNA疫苗的免疫原性，将含有糖／核蛋白融合基因的原核表达载体转化到大肠杆菌BL-21中和真核细胞BHK-21中，以检测融合基因的蛋白质表达及其免疫特性；同时，用核酸疫苗免疫家犬以检测核酸疫苗所产生的体液免疫和细胞免疫。结果表明狂犬病病毒G／N融合基因表达质粒可以产生较理想的免疫反应，为进一步的临床应用提供了科学依据。1．在本试验中，首先根据NCBI发表的狂犬病病毒SAD-B19株编码糖蛋白和核蛋白的基因序列，设计二对特异引物，并根据进一步的试验需求，在糖蛋白基因的两端插入限制性内切酶切位点BamHI和PstI；在核蛋白基因的两端插入限制性酶切位点PstI和NotI。通过PCR扩增狂犬病病毒SAD-B19株的G、N基因。将回收的目的片段用限制性核酸内切酶PstI进行酶切。回收酶切过的目的片段，用T4DNA连接酶将两基因片段连接。与pMD-18T载体过夜连接，构建克隆质粒。经过测序发现，获得的目的片段与GneBank上发表的基因序列几乎没有差异。经过DNAsis软件分析，连接两个基因的CTGCAG编码亮氨酸和谷胺酰氨。通过Jameson-Wolf抗原表位优势图分析表明，融合基因与单基因间在抗原位点上没有显著变化。2．将所构建的克隆质粒和原核表达载体pET32（a）用限制性内切酶BamHI、NotI进行双酶切，将获得的目的基因亚克隆到pET32（a）中，构建原核表达质粒pETGN。经酶切鉴定正确后，将pETGN转化到大肠杆菌BL21中。以IPTG诱导pETGN在大肠杆菌中的表达，以SDS-PAGE电泳分析所表达的蛋白质，获得目的蛋白质条带；经Western Blot检测，融合质粒表达的蛋白质与兔抗狂犬病病毒IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG产生免疫反应。这表明所构建的原核表达质粒具有免疫原性，为狂犬病病毒的临床检测提供了廉价的抗原。3．为了构建真核克隆质粒，先将根据NCBI发表的狂犬病SAD-B19核酸序列设计二对特异引物，在引物里含有下一步试验所必需的NotI、PstI和BamHI限制性核酸内切酶位点。经过PCR扩增，得到狂犬病病毒的G、N基因的片段。经PstI酶切G基因的3’端和N基因的5’端，回收基因片段，以T4DNA连接酶将两个基因连接，然后亚克隆到pMD-18T载体中。酶切、测序的结果表明，所构建的克隆质粒在几个抗原区内的碱基没有发生显著变异，融合后的基因没有改变抗原表位的优势性。4．将真核克隆质粒和pIRESneo用NotI、BamHI双酶切，将所获得的G／N融合基因和载体用T4D NA连接酶将载体与融合基因片段连接，获得真核表达质粒，经酶切鉴定后，转化到大肠杆菌DH5α中。以碱裂解法大量制备质粒，转染BHK-21细胞中。经过一定时间的培养后，提取细胞中的总RNA，经过RT-PCR检测，在总RNA中经逆转录和PCR扩增得到目的片段。将兔抗狂犬病病毒IgG（一抗）和异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG（二抗）对转染狂犬病病毒G／N融合基因真核表达质粒的BHK-21进行免疫荧光检测所表达的蛋白质。结果表明，真核表达质粒在BHK-21中表达了狂犬病病毒G／N融合蛋白质，并具有免疫原性。5．为进一步检验狂犬病病毒G／N融合基因的免疫原性，将所构建的核酸疫苗以100μg／kg体重的剂量接种到健康、成年和没有免疫接种过狂犬病疫苗的家犬。免疫间隔为10天，共免疫3次。然后采取免疫犬的外周血。以狂犬病病毒包被96孔培养板，采用间接ELISA法检测抗体水平，当待检免疫家犬外周血稀释100倍时，检测到不同免疫时间的抗体变化。结果表明，随着免疫次数的增加，抗体的OD490值也逐渐增大，但是，没有达到统计学上的显著水平。通过检测免疫犬的外周血中的CD4+、CD8+T淋巴细胞及其计算二者的比值发现，免疫犬外周CD4+、CD8+T淋巴细胞随着免疫的时间增加而有增加的趋势；同时，二者的比值却呈下降的趋势，表明在狂犬病病毒核酸疫苗免疫过程中，细胞免疫要比体液免疫强烈。将狂犬病灭活病毒和伴刀豆球蛋白作为特异性和非特异性刺激原对淋巴细胞进行刺激。结果表明，随着免疫时间的增加，淋巴细胞的OD590值随着免疫次数的增加而增加，揭示了记忆淋巴细胞的数量随着免疫时间的增加而增加。本试验通过对狂犬病病毒SAD-B19株编码糖蛋白和核蛋白的G、N基因进行克隆扩增、融合，构建以pET32（a）为载体的原核表达质粒和以pIRESneo为载体的真核表达质粒，经过检测原核表达质粒在大肠杆菌BL21、真核表达质粒在BHK-21细胞和家犬等表达的融合蛋白质免疫原性，证实了狂犬病病毒G／N融合基因核酸疫苗具有免疫原性，为其在狂犬病的预防及科学研究的合理应用提供了科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 综述一 狂犬病病毒分子生物学
• 1.生物学特性
• 1.1 形态与结构
• 1.2 结构蛋白及其功能
• 1.2.1 NP
• 1.2.2 PP
• 1.2.3 LP
• 1.2.4 MP
• 1.2.5 GP
• 1.3 狂犬病病毒的抗原蛋白
• 1.3.1 GP
• 1.3.2 NP
• 2.基因组
• 3.致病机理
• 综述二 狂犬病疫苗的研究进展
• 1.传统的活病毒疫苗
• 2.狂犬病灭活疫苗的发展概况
• 3.组织疫苗
• 4.亚单位疫苗
• 5.基因重组疫苗
• 6.核酸疫苗
• 试验一 狂犬病融合基因的构建、克隆及序列分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒质粒
• 1.1.2 菌株和试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要试剂的配制
• 1.2.2 G、N基因的PCR扩增
• 1.2.3 融合基因克隆质粒的构建
• 2.结果
• 2.1 G、N基因的PCR扩增结果
• 2.2 G/N基因的融合
• 2.3 克隆质粒的构建
• 2.4 Jameson-Wolf抗原表位优势及疏水性分析
• 3.讨论
• 4.小结
• 试验二 狂犬病原核表达质粒的构建与表达
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 工具酶
• 1.1.4 一抗和二抗
• 1.1.5 主要生化试剂
• 1.1.6 器材
• 2.试验方法
• 2.1 原核表达质粒的构建
• 2.1.1 技术路线
• 2.1.2 感受态大肠杆菌的制备
• 2.1.3 转化
• 2.1.4 筛选
• 2.1.5 酶切鉴定
• 2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.1 IPTG诱导
• 2.2.2 大肠杆菌裂解
• 2.3 电泳
• 2.3.1 分离胶
• 2.3.2 浓缩胶
• 2.3.3 电泳缓冲液
• 2.3.4 上样
• 2.3.5 电泳
• 2.3.6 转膜
• 2.3.7 转印
• 3.结果
• 3.1 pETGN的构建
• 3.1.1 pETGN的构建
• 3.1.2 酶切鉴定
• 3.2 PAGE电泳
• 3.2.1 诱导表达
• 3.2.2 电泳
• 3.3 Western Blot检测
• 4.讨论
• 4.1 表达质粒的构建
• 4.2 在E.coliBL21中的表达
• 4.3 Western Blot检测
• 5.小结
• 试验三 狂犬病G/N融合基因真核表达质粒的构建与分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒质粒
• 1.1.2 菌株和试剂盒
• 1.1.3 仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 主要试剂的配制
• 1.2.2 G、N基因片段的PCR扩增
• 1.2.3 融合基因克隆质粒的构建
• 2.结果与讨论
• 2.1 G、N基因的PCR扩增结果
• 2.2 G/N基因的融合
• 2.2.1 克隆质粒的构建
• 2.2.2 质粒序列分
• 3.小结
• 试验四 狂犬病G/N融合基因在BHK-21细胞中的瞬时表达
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 工具酶
• 1.1.4 一抗和二抗
• 1.1.5 主要生化试剂
• 1.1.6 器材
• 1.1.7 BHK-21细胞
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 真核表达质粒的构建
• 1.2.2 转染
• 1.2.3 RT-PCR鉴定
• 1.2.4 免疫荧光检测
• 2.结果
• 2.1 真核表达质粒的构建
• 2.1.1 酶切鉴定
• 2.1.2 酶切鉴定
• 2.2 RT-PCR检测结果
• 2.2.1 TRIzol提总RNA结果
• 2.2.2 PCR扩增结果
• 2.3 免疫荧光检测
• 3.讨论
• 3.1 BHK-21细胞对外源DNA质粒的表达
• 3.2 质粒的表达
• 4.小结
• 试验五 狂犬病病毒G/N融合基因疫苗在犬的免疫试验
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 DNA疫苗
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要材料
• 1.2 试验动物
• 1.3 免疫注射
• 1.4 采血及处理
• 1.5 ELISA检测抗体效价
• 1.5.1 试剂配制
• 1.5.2 操作步骤
• 1.6 T淋巴细胞亚类检测
• 1.6.1 外周血淋巴细胞的预处理
• 1.6.2 T淋巴细胞的荧光标记
• 1.7 外周血淋巴细胞转化试验（MTT比色法）
• 1.7.1 试剂
• 1.7.2 免疫犬外周淋巴细胞悬液的制备
• 1.7.3 淋巴细胞的诱导培养及检测
• 1.8 数据处理
• 2.结果
• 2.1 ELISA检测抗体结果
• 4⁺、CD₈⁺T淋巴细胞检测结果'>2.2 CD₄⁺、CD₈⁺T淋巴细胞检测结果
• 2.3 特异、非特异刺激犬外周血淋巴细胞
• 3.讨论
• 3.1 体液免疫
• 3.2 细胞免疫
• 4.小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢