论文摘要
疼痛严重危害人类健康,降低生活质量,增加家庭和社会负担。由外周神经损伤和病变造成的神经病理性疼痛是一种发病机制复杂、临床上难以治愈的慢性痛,人们一直致力于神经痛机制的研究和镇痛药物的开发。背根节（dorsal root ganglion, DRG）神经元是感觉传入的初级神经元,其上分布有多种P2X受体（P2X1-6）,其中P2X3受体高选择性地表达于与伤害性感受有关的中、小直径DRG神经元上。当机体受到伤害性刺激时嘌呤受体被细胞释放的三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate,ATP）激活,导致初级传入神经元兴奋性过度增加;同时,ATP还可以通过增加钙内流、调节谷氨酸、P物质（substance P, SP）、γ-氨基丁酸（GABA）、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）、神经生长因子（nerve growth factor, NGF）等疼痛相关物质的作用激活痛觉通路,导致痛敏。近年来嘌呤受体在疼痛中的作用逐渐引起了研究者的关注,以嘌呤受体为靶点的机理研究和药物开发已成为疼痛领域的研究热点。高乌甲素又名刺乌头碱、拉巴乌头碱（lappaconitine, LA）是从毛茛科植物高乌头根中提取分离的二萜生物碱。在中国和日本民间常将乌头根煎服用于祛风、除湿、散瘀、止痛等。LA是我国首创的非成癮性镇痛药,并被列为癌症患者三阶梯镇痛用药,具有临床应用无成瘾性,无致畸胎、无致突变、无蓄积中毒和不良反应少的优点。以前对LA的研究主要集中在LA的临床应用上,近年来也有关于LA作用机制的研究报道,但存在研究分散、粗浅、系统性不强等缺点,其确切的作用机制目前仍不明确。既往的研究大多认为LA镇痛的作用部位在脊髓以上中枢,涉及海马、导水管周围灰质（periaqueductal gray, PAG）、中缝大核（nucleus raphes magnus, NRM）等。有研究表明LA是Na+通道阻断剂和中枢性钙通道阻断剂,并可影响钾电流,涉及中枢去甲肾上腺系统、阿片系统及下行调制系统。但在临床上,LA早已广泛用于硬膜外麻醉（epidural anesthesia）、病人自控硬膜外镇痛（patient-controlled epidural analgesia, PCEA）、蛛网膜下腔阻滞（subarachnoid block）、区域阻滞（regional anesthesia）,且效果良好。亦有实验研究提示LA腹腔注射可抑制SP和生长抑素（somatostatin, SOM）对脊髓的作用;降低甲醛溶液致痛大鼠脊髓神经细胞c-fos的表达;明显缓解坐骨神经缩窄性损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve, CCI）大鼠的热痛觉过敏,同时使脊髓NF-κB的表达减少,这些均不能用脊髓上镇痛机制来解释,因此,我们推测可能有某种脊髓或脊髓下水平的镇痛机制存在。为了更好地指导临床用药,对LA的作用机制研究,尤其是对在脊髓、低级中枢、外周神经系统和非神经系统中的作用部位及机制研究的要求愈加迫切。P2X3受体为非选择性的阳离子通道,既往研究认为LA可能是阳离子通道阻断剂（Na+和Ca2+）,但二者之间是否存在相互联系迄今未见报道。我们的前期实验观察到LA腹腔注射能缓解ATP足底注射所致的疼痛反应,提示LA镇痛可能与P2X3受体有关,为了进一步明确LA和DRG神经元P2X3受体的相互关系和可能的作用机制,在本实验室对嘌呤受体研究的基础上,结合在体和离体实验,综合应用形态学、分子生物学及电生理学等多种方法,进一步观察LA对ATP致痛模型大鼠痛行为学（缩足反应）和DRG神经元P2X3受体表达的影响;观察LA对CCI模型大鼠行为学（热痛敏和机械痛敏）和DRG神经元P2X3受体表达的影响;观察LA对CCI模型大鼠DRG神经元ATP及其类似物α,β-meATP激活电流（ATP- andα,β-meATP-induced current, IATP and Iα,β-meATP）的影响;观察LA对CCI模型大鼠DRG神经元自发放电及ATP诱发放电的影响;并在鞘内应用P2X3受体反义寡聚核苷酸降低DRG神经元P2X3受体表达后,观察LA对CCI模型大鼠行为学（热痛敏和机械痛敏）的影响;从不同角度研究LA对DRG神经元P2X3受体介导的神经病理性疼痛的影响,并对这种调节作用的机制进行了初步的探讨。主要结果如下:1. LA抑制ATP足底注射所致的缩足反应和DRG神经元P2X3受体的表达增加大鼠ATP足底注射后缩足反应明显增加,LA腹腔注射能明显减轻ATP足底注射所致痛敏;免疫组织化学实验显示损伤侧L4-6节段DRG中、小直径神经元P2X3受体表达增加,LA处理使损伤侧L4-6节段DRG中、小直径神经元P2X3受体表达明显降低,且P2X3受体表达改变与痛敏的变化相一致。2.LA抑制CCI所致的大鼠机械痛敏和热痛敏,抑制CCI所致的大鼠DRG神经元P2X3受体的表达和介导的内向电流增加;鞘内注射P2X3受体反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide, A-ODN）降低DRG神经元P2X3受体的表达后,LA对CCI所致的痛敏的抑制作用减弱。⑴LA抑制CCI所致的大鼠机械痛敏、热痛敏和DRG神经元P2X3受体的表达增加CCI致大鼠机械痛阈、热痛阈下降,以及DRG神经元P2X3受体的表达增加;LA腹腔注射可以使CCI模型大鼠的机械痛阈、热痛阈上升以及DRG神经元P2X3受体的表达下降。⑵LA抑制CCI所致的大鼠DRG神经元P2X3受体介导的内向电流的幅度增加大鼠DRG神经元的IATP和Iα,β-meATP均有三种类型:快速脱敏感电流、慢速脱敏感电流及先快后慢的混合电流。CCI神经痛模型使大鼠相应节段DRG神经元产生IATP和Iα,β-meATP的神经元的数量增加,同时使快速和混合IATP和Iα,β-meATP的电流幅度升高。LA腹腔注射处理能抑制CCI所致的快速和混合IATP和Iα,β-meATP的电流幅度的升高,但对慢电流没有抑制作用。⑶鞘内注射P2X3受体A-ODN后,LA对CCI所致的痛敏的抑制作用减弱鞘内连续5天微量注射P2X3受体A-ODN,P2X3受体在DRG神经元的表达降低后,LA对CCI所致的痛敏的抑制作用明显减弱。3. LA抑制大鼠DRG神经元P2X3受体介导的ATP激活电流和诱发放电活动⑴LA抑制大鼠DRG神经元ATP激活电流LA细胞外应用对大鼠DRG神经元快速IATP和混合IATP的快速脱敏感成分有抑制作用,而对慢速IATP无抑制作用。且LA对大鼠DRG神经元快速IATP和混合IATP的快速脱敏感成分的抑制作用呈剂量依赖性。Na+通道阻断剂TTX不抑制LA对DRG神经元快速IATP的抑制作用。PLC抑制剂新霉素和PKC抑制剂Che能阻断LA抑制DRG神经元快速IATP的作用;而PKA抑制剂H89和G蛋白活化抑制剂GDP-β-s不影响LA抑制DRG神经元快速IATP的作用。⑵LA抑制大鼠DRG神经元的自发放电和ATP诱发放电在CCI模型大鼠DRG神经元上记录到自发放电,LA能抑制CCI所致的DRG神经元自发放电频率。细胞外应用ATP使正常大鼠DRG神经元产生诱发放电并使CCI模型大鼠DRG神经元放电频率增加,LA对正常和CCI模型大鼠DRG神经元放电频率增加均有抑制作用。PKC抑制剂Che和PLC抑制剂新霉素明显减弱LA对两组大鼠DRG神经元ATP诱发放电的抑制作用;而PKA抑制剂H89和G蛋白活化抑制剂GDP-β-s不影响LA对大鼠DRG神经元ATP诱发放电的抑制作用。本研究结果表明,大鼠DRG神经元P2X3受体表达增加和敏感性增强所致的ATP反应敏感性增强以及DRG神经元兴奋性增加在ATP足底注射致痛和坐骨神经损伤所致的神经痛的发生、发展中发挥了重要作用。LA抑制损伤所致的DRG神经元P2X3受体表达增加,抑制DRG神经元P2X3受体介导的ATP电流和神经元放电增加,通过改变DRG神经元P2X3受体表达和功能,降低初级神经元的敏感性和兴奋性,减少疼痛信息的产生和传导,从而缓解疼痛;其中可能涉及细胞内PKC和PLC信号通路。本研究能加深对LA镇痛机制的理解,为LA的临床应用和疼痛治疗提供新的思路。