论文摘要
鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）是一种类型独特的环状单链（负链）DNA病毒。研究证实VP3蛋白（Apoptin,亦称凋亡素）是CAV的功能蛋白,可广泛诱导肿瘤细胞凋亡,而且仅诱导具有致瘤表型细胞或转化表型细胞的凋亡,而对正常二倍体细胞无凋亡效应、无细胞毒性。并且,VP3诱导凋亡途径为P53非依赖型,不受Bcl-2高表达的抑制。传统化疗药物常常由于P53突变导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低,因此,VP3蛋白是一种更具应用前景的抗肿瘤生物制剂。细胞透膜肽（Cell-Penetrating Peptide,CPP）是一类能携带生物大分子进入细胞的短肽,它不依赖经典的细胞内吞。大量的研究表明细胞透膜肽具有强大的运载潜能,不仅可以携带多肽、GFP、RNaseA而且可以携带DNA、反义核酸、有机分子、脂质体等。与其他的蛋白质形成的融合蛋白也能透过细胞膜,并发挥这些蛋白质的生物学功能。因此,本研究正是将两者结合在一起,为肿瘤等疾病的治疗提供新思路。本课题组在前期研究中已证明PTD4能通过生物合成而实现其融合蛋白PTD4-GFP-VP3对体外培养的多种细胞的透膜作用。本研究分别从体内外实验观察PTD4-VP3融合蛋白诱导宫颈癌细胞凋亡的效应。利用PTD4-VP3融合蛋白的原核表达载体,经IPTG诱导融合蛋白表达,镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。利用流式细胞仪检测融合蛋白体外诱导人宫颈癌Hela细胞的凋亡效率。在此基础上,建立人宫颈癌Hela细胞异种移植裸鼠模型,将融合蛋白PTD4-VP3,涂抹在宫颈癌皮下移植瘤的皮肤表面,治疗7天后,比较皮下移植瘤大小并利用TUNEL法观察PTD4-VP3融合蛋白诱导宫颈癌细胞的凋亡效应及对正常组织的毒性。结果显示:随着融合蛋白PTD4-VP3孵育Hela细胞时间的延长,细胞总凋亡率升高,在孵育48小时后细胞总凋亡率最高,达59.73%;裸鼠宫颈癌皮下移植瘤生长曲线显示,治疗组和对照组在涂抹前瘤块体积不存在明显差异（P=0.9533,P>0.05）,经融合蛋白涂抹治疗7天后,治疗组裸鼠的瘤块生长速度低于对照组瘤块,治疗结束时两组间瘤块体积有差异,具有统计学意义（P=0.0115,P<0.05）。根据第7天测量的两组瘤块的体积,经计算肿瘤生长抑制率为66.36%。;TUNEL-DAB染色法检测到治疗组宫颈癌细胞的大范围凋亡,对照组宫颈癌细胞少见凋亡;HE染色未见治疗组裸鼠主要脏器发生凋亡。结论:PTD4-VP3融合蛋白可以透过皮肤,并通过特异性诱导肿瘤细胞凋亡的方式抑制肿瘤生长,为进一步VP3治疗肿瘤的研究奠定了基础。
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