hPPARs天然配体筛选平台的建立及应用

论文摘要

目的建立人过氧化物酶体增殖物活化受体（human peroxisome prolifterator-activated receptors,hPPARs）配体的筛选平台,并从中药单体中筛查hPPARs的天然配体。方法从人肝癌组织提取总RNA,RT-PCR扩增出hPPARs配体结合区（ligand binding domain,LBD）cDNA,将其克隆入表达载体pMAL-p2x麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein,MBP）编码基因malE序列的下游,转化入E coli.TB1。含重组质粒的宿主菌经最佳优化条件诱导后,超声破碎取上清。产物用多糖亲和树脂进行纯化,纯化的MBP-hPPARsLBD用Xa因子酶切、多糖亲和树脂层析、DEAE-52阴离子交换层析纯化回收。放射性标记配基结合实验（radioligand binding assays,RBA）鉴定MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的配体结合功能。高效液相色谱紫外检测法（high performance liquid chromatography and ultraviolet detection,HPLC-UV）建立hPPARsLBD配体的筛选平台,并对待试中药单体进行筛选,用经典的放射性标记配基竞争结合实验（radioligand binding competition assays,RBCA）法对HPLC-UV法筛选结果进行检验。反式激活报告基因法测定筛出药物的功能活性。结果含重组质粒的宿主菌经最佳优化条件（0.4 mmol/L,30℃振荡培养6 h）诱导,从1L培养物中可获得约20 mg MBP-hPPARsLBD,约占胞质总蛋白的31%。经纯化以及酶切回收,获得了电泳纯的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD,其产量分别为14 mg/L和5 mg/L,得率分别为70%和45%。RBA显示MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD的结合配体功能是等效的。根据分子排阻色谱分离（Molecular Exclusion Chromatography,MEC）理论建立了HPLC-UV法hPPARs配体筛选平台。用该平台对待试药进行了筛选,结果显示小檗碱（berberine,Ber）和柚皮素（naringenin,Nar）能特异性结合hPPARα,大豆苷元（daidzein ,Dai）能特异性结合hPPARα和hPPARγ1。RCBA法结果与HPLC-UV法相同。用反式激活报告基因法测试待试中药单体的功能活性,结果显示,Dai、Ber和Nar能激活hPPARα,Dai、Nar和姜黄素（curcumin ,Cur）能激活hPPARγ1,而Dai、Ber、Nar、虎杖苷（polydatin, Pol）对hPPARδ有一定程度的激活作用。结论1)利用pMAL-p2x表达纯化体系,获得了大量、可溶的、电泳纯的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD。经RBA鉴定,MBP的融合没有影响hPPARsLBD的配体结合功能;2)HPLC-UV法为一种新的,简便、经济、环保、有效的受体配体筛选方法,可用于研究受体配体结合反应;3)确认Ber、Nar是hPPARα的天然激动剂,Dai为hPPARα和hPPARγ1的双激动剂。此外,Cur对hPPARγ1, Dai、Ber、Nar、Pol对hPPARδ有一定程度的激活作用。提示Dai、Ber、Nar、Pol和Cur等中药单体至少通过激动hPPARs,调节下游多个靶基因表达,从而发挥调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗炎等多种药理效应。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：hPPARs 天然配体筛选平台的建立及应用
• 前言
• 第一部分 hPPARsLBD 在大肠杆菌中的高效可溶表达、纯化和功能鉴定
• 1 实验材料和方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 基于配体结合活性的hPPARs 配体筛选平台的建立及应用
• 1 实验材料和方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第三部分 hPPARs 天然配体的功能活性研究
• 1 实验材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 过氧化物酶体增殖物活化受体及其天然配体
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文