TcLr35小麦抗病相关基因的克隆及分析

论文摘要

植物抗病基因克隆研究对于抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。而小麦不仅基因组庞大(1.6×1016bp),相当于水稻基因组的近40倍,且重复序列含量丰富,这些特点使寻找小麦抗病基因区段两侧的分子标记比较困难,增加了染色体步移或重叠克隆群构建的难度。抗病基因同源片段的克隆,定位及其与已知抗病基因的连锁分析,为克隆小麦抗病基因提供了新的思路。本论文根据已克隆的植物抗病基因保守结构域设计引物,采用同源克隆技术,并结合cDNA末端快速扩增（rapid amplificationcDNA end,RACE）和热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）技术对小麦抗病基因同源序列进行了研究。同时,利用RT-PCR（Reversetranscription PCR）和RACE技术筛选TcLr35小麦病程相关蛋白基因cDNA全长。主要研究结果如下: （1） 根据抗病基因核苷酸结合位点（nucleotide binding site,NBS）、富含亮氨酸重复（Leucine-rich repeats,LRR）保守结构域设计引物,从携带小麦抗叶锈病基因Lr35的回交6代近等基因系TcLr35中获得了4个通读的小麦抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2、S2A2和LRR1。其中3个片段含有NB-ARC保守结构域,与已知抗病基因12C-1,L6,RPS2等相应区域相一致,具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a、激酶3a等）。LRR1含有3个完整的LRR重复单元,与水稻抗白叶枯病基因Xa21基因具有较高同源性。 （2） 以S2A2为靶序列,利用RACE技术获得了cDNA全长2693bp的TcLr35小麦抗病相关基因,该基因包含1887bp的开放阅读框,230bp的5′非翻译区（untranslated region,UTR）,533bp的3′非翻译区和21bp的多聚腺苷酸尾。在233bp处有ATG起始密码子,2117bp处有TAG终止密码子,编码628个通读的蛋白质氨基酸序列,基因编码产物具有NBS、LRR等抗病基因保守结构域。初步认为S2A2基因为CC-NBS-LRR类抗病相关基因。在GenBank获得的登录号为DQ205351。利用半定量RT-PCR技术对该基因的表达情况研究表明,S2A2基因为低丰度组成型表达,其表达不受病原菌接种的诱导。 （3） 利用热不对称交错PCR技术获得了2个Lr35相关基因组DNA片断RGA1的侧翼序列,长度分别为511bp和614bp,与RGA1重叠区分别为293bp和509bp,分别向3′端和5′端延长了208bp和100bp,拼接后序列为915bp。经BLASTn同源性比较,与小麦抗叶锈病基因Lr21同源性为93%（score值为674,E值为0.0）,与含有Lr10基因的450kb大片断重叠群同源性为90%（score值为260,E值为7e-66）。 （4） 根据已发表的植物病程相关蛋白1基因和B（1,3;1,4）葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35中获得2个病程相关蛋白基因cDNA全长。其中,756bp的小麦病程相关蛋白1基因PR12包含495bp的开放读码框,147bp的5′非翻译区（untranslated region,UTR）,155b19的3′非翻译区和21bp的多聚腺苷酸尾。编码164个通读的蛋白质氨基酸序列,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与GenBank中多个植

论文目录

• 引言
• 第一章 TcLr35小麦抗病基因同源序列的分离与鉴定
• 第一节 TeLr35小麦中NBS类抗病基因同源序列的分离
• 1 材料与方法
• 1.1 TcLr35小麦中NBS类抗病基因同源片段的分离
• 1.2 TeLr35小麦抗病相关基因S2A2全长cDNA的获得
• 1.3 半定量RT-PCR分析方法检测TcLr35小麦S2A2基因的转录表达
• 1.4 TcLr35基因组DNA中S2A2基因的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 TcLr35小麦中NBS类抗病基因同源片段的获得
• 2.2 小麦抗病相关基因S2A2全长cDNA的获得
• 2.3 S2A2基因编码蛋白质产物的结构分析及功能预测
• 2.4 TcLr35小麦S2A2基因表达的半定量RT-PCR分析
• 2.5 小麦基因组中全长基因的克隆
• 第二节 TcLr35小麦中LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 TcLr35小麦中LRR类抗病基因同源片段的分离
• 1.2 利用RACE技术获得LRR13′末端
• 2 结果与分析
• 2.1 TcLr35小麦中LRR类抗病基因同源片段的获得
• 第三节 小麦抗病基因同源序列RGA1侧翼序列的扩增与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果及分析
• 2.2 RGA13′端侧翼序列的获得
• 2.3 RGA15′端侧翼序列的获得
• 2.4 RGA1拼接序列的获得
• 2.5 特异性引物扩增RGA1拼接序列
• 本章讨论
• 第二章 TeLr35小麦中植物病程相关蛋白基因的研究
• 第一节 TcLr35中病程相关蛋白1基因的克隆及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 TeLr35小麦病程相关蛋白1cDNA片段的克隆
• 2.2 利用5′RACE获得cDNA全长
• 2.3 TcLr35小麦PR12基因的蛋白结构特征分析
• 2.4 PR12基因在TcLr35小麦基因组中的分布
• 第二节 TcLr35中β（1，3；1，4）葡聚糖苷酶基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 β（1，3：1，4）葡聚糖苷酶基因cDNA片段的克隆及分析
• 2.2 PR34全长cDNA的获得
• 2.3 TcLr35小麦β（1.3，1.4）葡聚糖苷酶基因的蛋白结构特征分析
• 2.4 PR34基因在TcLr35小麦基因组中的分布
• 本章讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 附录A 小麦叶锈病侵染型
• 附录B 试验所用试剂
• 附录C 登录在GenBank中的序列
• 附录D 缩略表
• 在读期间发表的论文
• 作者简介
• 致谢