水稻白叶枯病菌PX099中avrBs3/pthA家族基因的克隆与功能研究

论文摘要

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病（Bacterial Leaf Blight of Rice）,是世界性的水稻重要病害。如同其它革兰氏阴性植物病原细菌—样拥有hrp基因（hypersensitive response on nonhost plants and pathogenicityon host plants）和无毒基因（avrirulence gene）或毒性基因（virulence gene）。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应（hypersensitive response,HR）和在感病寄主植物上的致病力（pathogenicity）。毒性基因则是以基因对基因互作的方式决定着寄主专化性。研究水稻白叶枯病菌的无毒基因,将有助于鉴定和克隆水稻的抗病基因,进一步明确无毒基因与抗病基因的互作的分子机制。Xoo基因组中存在着众多的avrBs3/pthA家族基因,为了了解这些基因在PXO99基因组中的存在特点,本实验利用来源于水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ的2.67Kb的无毒基因avrXa3重复区的2.4kb-BamHI片段作探针检测PXO99基因文库,通过菌落原位杂交及Southern杂交,将所得结果进行归类和分析,从87个阳性克隆中鉴定出13个不同的阳性克隆,它们在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。这基本上明确了PXO99基因文库所含的avrBs3/pthA家族基因的数量、类型及排列方式,为今后的研究提供了基本信息。在前人研究基础上,本实验对PXO99及其突变体PXO△avr做了进一步的研究,通过对其基因组酶切、southern杂交及作图分析,发现突变体PXO△avr与PXO99相比缺失了三条带,而有两条带信号减弱。对比PXO99基因文库的检测结果,发现有三个克隆P5、P8和P67与突变体PXO△avr缺失的信号带相对应,克隆P5包含了这五条带,克隆P8和P67分别包含了其中的三条与两条带。（丬寽）这三个文库克隆（P5,P8,P67）导入突变体PXO△avr,经苗期接种实验表明:P5互补突变体能使其毒性恹复接近PXO99菌株的致病表型,但并不是全部恹复,P8对表型影响较小,P67也能部分恹复突变体的功能。因此,推测由于随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除,文库克隆P5、P8和P67与缺失突变体缺少的条带相关。同时也表明缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。avrBs3/pthA家族基因之间的作用比较复杂,受多重因素的影响。经过对PXO99基因文库中无毒基因的研究分析,从中获得2个avrBs3/pthA家族基因克隆,P3.1和P3.4。序列测定结果显示,它们存在与PXO99基因组中,与avrBs3/phA家族成员一样,具有几乎一样的5′端和3′端、1个亮氨酸拉链（leucine zipper,LZ）、3个核定位信号（nuclear localization signal,NLS）和1个酸性转录活化域（acidictranscriptional activation domain,AAD）,不同的只是所含102 bp重复单元的重复次数不等:P3.1有12.5个重复,P3.4有15.5个重复。它们分别与本实验室从JXOV中得到的克隆S11及已知的从PXO86中得到的克隆avrXa10舍有相同的重复数,经过比对,它们的可变区及其它区域均存在着差异。为了比较这些具有相同重复数,但序列不完全一致的克隆其功能是否相似或相同,本实验将其导人经过200mM 5-氮胞苷（5-anacytidine）标记的中国菌株OS-198和KS6-6中接种水稻近等基因系进行了致病性测验。结果表明这些具有相同重复数,但序列不完全相同的avrBs3/pthA家族基因,在水稻近等基因系上的致病能力并不完全一致,这也说明,无毒基因重复区中的可变区对于基因的功能是重要的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 水稻黄单胞菌中AVRBS3/PTHA家族基因和植物抗病基因的研究进展
• 1 水稻黄单胞菌中无毒基因的鉴定
• 2 水稻黄单胞病菌中avrBs3/pthA家族基因的待征及其在基因组中的分布
• 3 avrBs3/pthA家族基因的功能
• 4 水稻黄单胞病菌AvrBs3/PthA家族基因是由Ⅲ型分泌系统泌出的效应分子
• 5 avrBs3/pthA家族基因的进化
• 6 讨论与展望
• 下篇 研究内容
• 第一章 白叶枯病菌PXO99基因文库中的AVRBS3/PTHA家族基因初探
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二章 水稻白叶枯病菌PXO99及其突变体PXO△AVR的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第三章 几个具有相同重复数的AVRBS3/PTHA家族基因的比较研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录 本实验用到的载体
• 致谢
• 本论文研究受资助基金