论文摘要
【研究背景】ERFs（Ethylene Responsive Factors）是植物特有的一类转录因子,在植物的生长发育与胁迫应答过程中具有重要的调控作用。本实验室以NP24启动子上GCC-box为诱饵,通过酵母单杂交的方法从番茄cDNA文库中筛选得到5个ERF蛋白新成员,它们可与乙烯和/或茉莉素应答元件结合,分别命名为JERF1/JERF3/TERF1/TERF2/TSRF1,统称为JERFs（Jasmonate and ethylene responsiveelement binding factors）。前期研究工作表明JERFs转录因子参与了烟草多种生物胁迫和非生物胁迫的应答过程。但JERFs转录因子在其它植物中是否具有同样的作用及其如何协调不同胁迫应答信号途径的机理仍不清楚。【目的】剖析TERF2提高苗期水稻低温胁迫耐性的调节作用及其分子基础;创建超表达Tag-JERFs融合蛋白拟南芥,为研究JERFs在拟南芥中的生理功能以及分离鉴定JERFs在拟南芥中的重要互作蛋白质提供重要的材料。【方法】本研究以转TERF2水稻为材料,利用生物化学方法和RT-PCR、Real-timePCR方法研究TERF2对苗期水稻低温相关生理生化指标和抗逆功能基因表达的影响,进一步对TERF2所调控靶基因启动子中的顺式作用元件进行分析,进而探讨TERF2调节苗期水稻中重要低温胁迫应答反应基因的分子基础;同时利用分子克隆技术构建Tag-JERFs植物超表达载体,利用电击法转入农杆菌LBA4404,采用花序浸泡法转化至拟南芥,创建超表达Tag-JERFs融合蛋白拟南芥。以转Tag-JERFs拟南芥为材料,采用生理学实验探讨JERFs转录因子在拟南芥不同信号途径中的作用。【结果】（1）ERFs转录因子TERF2不仅对水稻全生育期的生长发育没有影响,而且能明显提高苗期水稻对低温的耐性。（2）TERF2能明显提高低温胁迫下水稻苗期叶片中渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸的含量,并通过稳定低温胁迫下水稻苗期叶片中叶绿体生物发生相关基因（OsHAP3A、OsHAP3B和OsHAP3C）和小分子跨膜蛋白基因（OsLti6a和OsLti6b）的表达,激活相关抗氧化酶基因（SODB、APX1和APXb）的表达,从而维持叶绿素的含量,减少脂质过氧化产物MDA的积累,保持细胞质膜的稳定性与完整性,进而减少光合效率的损失与质膜的透性,提高苗期水稻对低温的耐性。（3）TERF2能显著激活正常生长条件下水稻中相关调控蛋白基因（OsMYB、OsICE1和OsCDPK7）和低温应答功能基因（OsSPDS2和OsEnol）的表达,提高水稻在低温逆境胁迫下的耐受能力。（4）TERF2可能主要通过与下游靶基因启动子中的GCC-box和/或DRE/CRT元件相互结合,从而在转录水平上激活这些靶基因的表达。（5）构建了His-TERF2融合基因植物超表达载体,并转化至拟南芥中,筛选得到单拷贝转基因拟南芥株系6个。（6）构建了HA-JERFs融合基因植物超表达载体,并转化至拟南芥中,筛选得到单拷贝转HA-TSRF1拟南芥株系9个,单拷贝转HA-JERF1拟南芥株系6个,单拷贝转HA-JERF3拟南芥株系2个,单拷贝转HA-TERF1拟南芥株系3个,单拷贝转HA-TERF2拟南芥株系3个。（7）JERF1、JERF3和TERF1能够降低拟南芥种子萌发对盐的敏感性,而TERF2能够增加拟南芥种子萌发对盐的敏感性;JERF1和JERF3能够降低拟南芥种子萌发和拟南芥生长对甘露醇的敏感性,而TERF1和TERF2能够增加拟南芥种子萌发和拟南芥生长对甘露醇和ABA处理的敏感性;JERF1和JERF3能够降低拟南芥种子萌发对葡萄糖的敏感性,而TERF1和TERF2能够增加拟南芥种子萌发对葡萄糖的敏感性;此外,JERF1、JERF3、TERF1和TERF2均参加拟南芥中乙烯所引起的“三重反应”,这些试验结果表明JERFs转录因子参与拟南芥的多个信号转导途径。【结论】（1）TERF2可能主要通过与水稻中相关调控基因和低温应答基因启动子中的GCC-box和/或DRE/CRT等顺式作用元件结合,从而在转录水平上激活这些调控基因和低温应答基因的表达,激活水稻体内低温应答的生理生化与分子机制,提高苗期水稻对低温胁迫的耐受能力,并且不影响水稻全生育期内的生长发育。（2）创建了稳定超表达His-TERF2、HA-TSRF1、HA-JERF1、HA-JERF3、HA-TERF1、HA-TERF2等6个标签-JERFs融合蛋白的转基因拟南芥。（3）JERFs转录因子在拟南芥的渗透胁迫应答、ABA信号、糖信号以及乙烯信号等多个途径中具有重要的调节作用。