云南白芸豆过氧化物酶的提取及其酶学性质的研究

论文摘要

过氧化物酶[Peroxidase, POD, EC1.11.1.7（x）]是一类以血红素为辅基的酶,在生物中广泛存在,具有多种不同的生物功能,主要催化H2O2和有机过氧化物对多种有机物和无机物的氧化作用。它在蛋白质、多肽、激素、病毒、寄生虫、生物降解及神经系统等方面都有应用,具有特异性强,灵敏度高等优点。此酶已经作为一种商品化试剂广泛用于生物学研究并成为重要的诊断试剂。植物来源的过氧化物酶研究最深入的是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）,大豆过氧化物酶由于良好的热稳定性和较宽范围pH值受到极大的重视。白芸豆过氧化物酶是从白芸豆提取凝集素和淀粉酶抑制剂后从种皮中得到的,其酶学特性与大豆过氧化物酶相似,并且云南有稳定的原料来源,有利于白芸豆的综合开发利用。本文对白芸豆种皮过氧化物酶采用了去离子水提取,分析了酶的热稳定性和酸碱稳定性。比较并摸索出提取的合适方法和条件。同时应用双水相萃取法和水溶性壳聚糖沉淀法进行了分离和纯化的初步探讨。将此酶应用于葡萄糖检测。实验结果表明,白芸豆种皮过氧化物酶的热稳定性和酸碱稳定性略低于大豆种皮过氧化物酶。去离子水提取条件为4℃、48小时、pH为7。双水相萃取法具有快速，操作简单，可在常温下操作，提取条件为10％PEG6000+12％（NH4）2SO4,pH=8。水溶性壳聚糖沉淀回收是可行的,回收条件为室温、搅拌20min、pH值为6、壳聚糖浓度在40mg/L。白芸豆过氧化物酶在葡萄糖检测上表现出与大豆过氧化物酶相同的酶活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 过氧化物酶简介
• 1.1.1 植物过氧化物酶
• 1.1.2 哺乳动物过氧化物酶（Mammalian peroxidase）
• 1.1.3 LiP（Lignin peroxidase）
• 1.1.4 锰过氧化物酶（MnP,Manganese peroxidase）
• 1.1.5 POD分子结构特点
• 1.2 过氧化酶的化学性质
• 1.2.1 机理
• 1.2.2 过氧化物酶底物
• 1.3 过氧化物酶的应用
• 1.3.1 食品检验
• 1.3.2 食品添加剂
• 1.3.3 酶联免疫分析
• 1.3.4 临床检验试剂
• 1.3.5 工业方面
• 1.4 酶的分离、纯化和鉴定
• 1.5 本论文研究的目的、意义及研究思路和内容
• 1.5.1 研究的目的、意义
• 1.5.2 研究思路和内容
• 第二章 白芸豆过氧化物酶的提取
• 2.1 白芸豆过氧化物酶的提取
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 缓冲液配制
• 2.2 粗酶液制备条件的确定
• 2.2.1 提取溶剂的选择
• 2.2.2 提取时间的选择
• 2.2.3 提取温度的选择
• 2.2.4 提取pH的选择
• 2.2.5 热稳定性
• 2.2.6 酸碱稳定性
• 2.3 过氧化物酶液浓度和活力测定
• 2.4 SDS-PAGE电泳
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 提取溶剂的选择
• 2.5.2 提取时间的选择
• 2.5.3 提取温度的选择
• 2.5.4 提取pH的选择
• 2.5.5 正交实验优化白芸豆过氧化物酶的提取条件
• 2.6 白芸豆豆皮中的过氧化物酶
• 2.6.1 通过对照实验可知白芸豆豆皮中含有过氧化物酶
• 2.6.2 热稳定性
• 2.6.3 酸碱稳定性
• 2.7 小结
• 第三章 双水相萃取法分离云南白芸豆中过氧化物酶
• 3.1 实验方法
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 试剂与仪器
• 3.2.3 粗酶液的制备
• 3.3 实验条件的确定
• 3.3.1 PEG分子量对酶活性的影响
• 3.3.2 PEG6000浓度对酶活性的影响
• 4）₂SO₄浓度对白芸豆过氧化物酶活性的影响'>3.3.3 （NH₄）₂SO₄浓度对白芸豆过氧化物酶活性的影响
• 4）₂SO₄双水相体系对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响'>3.3.4 PEG/（NH₄）₂SO₄双水相体系对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响
• 3.3.5 pH对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响
• 3.4 盐析法及双水相萃取法制备过氧化物酶
• 3.4.1 盐析法
• 3.4.2 双水相萃取法
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 PEG6000浓度对酶活性的影响
• 3.5.2 PEG分子量对白芸豆过氧化物酶酶活性的影响
• 4）₂SO₄浓度对白芸豆过氧化物酶活性的影响'>3.5.3 （NH₄）₂SO₄浓度对白芸豆过氧化物酶活性的影响
• 4）₂SO₄双水相体系对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响'>3.5.4 PEG/（NH₄）₂SO₄双水相体系对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响
• 3.5.5 pH对白芸豆过氧化物酶分配系数的影响
• 3.5.6 双水相法和盐析法制备白芸豆过氧化物酶的各项指标
• 3.6 小结
• 第四章 水溶性壳聚糖回收云南白芸豆过氧化物酶
• 4.1 壳聚糖絮凝机制
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验条件的确定
• 4.3.1 蛋白含量测定
• 4.3.2 标准曲线的测定
• 4.3.3 不同絮凝剂浓度对絮凝效果的影响
• 4.3.4 不同pH值对絮凝效果的影响
• 4.3.5 不同搅拌时间对絮凝效果的影响
• 4.3.6 不同温度对絮凝效果的影响
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 不同絮凝剂浓度对絮凝效果的影响
• 4.4.2 不同pH值对絮凝效果的影响
• 4.4.3 不同搅拌时间对絮凝效果的影响
• 4.4.4 不同温度对絮凝效果的影响
• 4.5 正交实验优化白芸豆过氧化物酶的回收条件
• 4.5.1 因素水平设计
• 4.5.2 正交实验设计
• 4.6 小结
• 第五章 应用白芸豆过氧化物酶检测葡萄糖
• 5.1 试剂与仪器
• 5.2 试剂配制
• 5.3 标准曲线制作
• 5.4 葡萄糖检测
• 5.4.1 标准曲线
• 5.4.2 葡萄糖检测
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢