非食用色素苏丹红Ⅰ和二苯甲酮酶联免疫检测方法的研究

论文摘要

苏丹红是一种人工合成的工业染料,二苯甲酮是光引发剂被用于包装材料中,均具有潜在致癌性。本论文旨在建立一种苏丹红Ⅰ、二苯甲酮残留的酶联免疫（ELISA）快速检测方法。通过重氮化法合成2种苏丹红Ⅰ衍生物,通过LC/MS鉴定后分别与BSA、OVA偶联,得到免疫原和包被原,紫外分光光度法测得偶联率15.6、10.4,用免疫原免疫新西兰大白兔两只,获得多克隆抗体。J检测抗血清得到效价均达到64000,然后选择其中一只兔子的抗血清,初步建立苏丹红Ⅰ的间接竞争ELISA方法。并对包被液,封闭液,样品稀释液,抗体稀释液,一抗反应时间和二抗反应时间等影响苏丹红ⅠELISA反应的因素进行优化,在最优条件下建立了苏丹红Ⅰ的标准曲线,得到线性回归方程为y = -0.3508x + 0.6503,R2= 0.9989,其中苏丹红Ⅰ的半数抑制量（IC50）为3.0ng/mL,检测限（LOD）为0.1ng/mL,线性范围为0.3～23.4ng/mL,与苏丹红结构类似物对位红交叉率140%、与苏丹红Ⅱ、Ⅲ、G交叉率小于10%,苏丹红Ⅳ交叉率小于1.0%。以辣椒粉为样本,在5ng/g和20ng/g添加水平下得到回收率分别为90.4%和96.0%,变异系数分别为1.8%和4.9%。以二苯甲酮类似物作为半抗原,采用重氮化法与BSA偶联,合成免疫原,采用戊二醛法与OVA偶联得到包被原,紫外分光光度法测得偶联率分别为17.8和11.5,用免疫原免疫两只新西兰大白兔,获得多克隆抗体。用方阵滴定法得到2只兔子的抗血清效价分别为128000、256000,然后以效价较高的抗血清初步基础建立二苯甲酮的间接竞争ELISA方法。对包被液,封闭液,以及不同pH值、NaCl浓度、甲醇浓度的样品稀释液等影响二苯甲酮ELISA反应的因素进行优化,在最优条件下建立了二苯甲酮的标准曲线,得到线性回归方程为y = -0.3422x + 0.9703, R2= 0.9976,其中IC50为23.7ng/mL,LOD为2ng/mL,线性范围为3.2～177.6ng/ml。与其它结构类似物4.4-二N,N-二甲氨基二苯甲酮、2.4-二羟基二苯甲酮的交叉反应都小于1%,抗体具有很好的特异性。以包装纸为样本,在50ng/g和150ng/g添加水平下得到回收率分别为92.8%和94.5%,变异系数分别为2.7%和4.5%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、绪论
• 1.1 苏丹红研究进展
• 1.1.1 苏丹红的理化性质及代谢
• 1.1.2 苏丹红在食品中的残留现状及分析方法
• 1.2 二苯甲酮研究进展
• 1.2.1 二苯甲酮的理化性质及代谢
• 1.2.2 二苯甲酮残留检测现状
• 1.3 本课题研究内容、目标
• 二、苏丹红ELISA 检测方法的建立
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 药品与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 溶液系统
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 免疫原的合成和鉴定
• 2.2.2 多克隆抗体的制备
• 2.2.3 间接ELISA 方法的建立和优化
• 2.2.4 ELISA 方法的评估
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 半抗原的鉴定
• 2.3.2 人工抗原的合成和鉴定
• 2.3.3 抗苏丹红抗体的效价和工作浓度的测定
• 2.3.4 ELISA 各参数的优化
• 2.3.5 优化后的ic-ELISA
• 2.3.6 交叉反应
• 2.3.7 实际样品添加回收率
• 2.4 小结
• 三、二苯甲酮ELISA 检测方法的建立
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 药品与试剂
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 溶液系统
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 免疫原的合成和鉴定
• 3.2.2 多克隆抗体的制备
• 3.2.3 间接ELISA 方法的建立和优化
• 3.2.4 ELISA 方法的评估
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 人工抗原的合成和鉴定
• 3.3.2 二苯甲酮抗体的效价和工作浓度的测定
• 3.3.3 ELISA 各参数的优化
• 3.3.4 优化后的ic-ELISA
• 3.3.5 交叉反应
• 3.3.6 实际样品添加回收率
• 3.4 小结
• 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文