识别氨基酸序列的aptamer蛋白配体研究

论文摘要

我们设计了一种新的蛋白配体，这种配体能够识别蛋白质的氨基酸序列并捕获蛋白。这种方法的原理是能够识别三肽的DNA aptamer可以识别蛋白内部的相同序列。我们使用小鼠Cathepsin D蛋白来验证这个方法。根据发表的Cathepsin D蛋白的氨基酸序列选择四个三肽：Leu-Ala-Ser（LAS）、Asp-Gly-Ile（DGI）、Gly-Glu-Leu（GEL）和Lys-Ala-Ile（KAI）。通过指数富集的配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment，SELEX）技术筛选能够结合LAS、DGI、GEL和KAI这些三肽的DNA aptamer。用structure-switch signaling aptamer的方法进行检测，结果表明这种筛选得到的aptamer能够识别Cathepsin D蛋白中的相应序列，并且Cathepsin D蛋白可以被多种aptamer包被的磁珠捕获。这四个aptamer能够通过滚环DNA复制的方法检测到fM浓度的Cathepsin D蛋白。这是一种非常有潜力的蛋白芯片配体，可以应用到蛋白芯片技术中。筛选能够识别三肽的aptamerLAS、DGI、GEL和KAI三肽合成后分别偶联到HiTrap NHS活化柱上。起始单链DNA随机库为96个碱基短链核苷酸的混合物，其中含有60个随机插入序列。洗脱与三肽结合的单链DNA后进行PCR扩增，再进行单链PCR，得到的单链PCR产物进一步使用三肽亲和柱筛选，这样可以生成亚库。筛选过程重复了12次后，对最后得到的产物进行克隆和测序。选择GEL-aptmer、KAI-aptmer、DGI-aptamer和LAS-aptamer四个aptamer作为配体，以此来验证根据蛋白质氨基酸序列识别和捕获蛋白的技术。验证aptamer与蛋白之间的相互作用我们推测能够结合三肽的aptamer同样可以结合蛋白中所含有的相同序列。采用structure-switching signaling aptamer的方法来验证aptamer与蛋白之间的相互作用。在这个实验中，当蛋白和aptamer相互作用时会产生可以被检测到的荧光信号。结果表明加入Cathepsin D蛋白可以增加荧光信号而且随浓度升高荧光增强，但是加入的BSA即使在高浓度也不会生成荧光信号。这个结果表明与三肽相互作用的aptamer可以结合蛋白中所含有的相同序列，并且它们之间的相互作用具有特异性。Aptamer组合可以捕获Cathepsin D蛋白我们推测四个aptamer可以与Cathepsin D蛋白上的四个三肽序列结合，所以将对Cathepsin D蛋白有最高的亲和性。依此类推，三个aptamer将会比两个aptamer的亲和性高。在部分纯化的小鼠Cathepsin D蛋白中混入大量BSA蛋白和溶菌酶形成混合蛋白溶液，将生物素标记的aptamer结合到链霉素亲和素标记的磁珠上，这个蛋白溶液与磁珠相互作用，通过盐浓度梯度洗脱后用NaOH溶液洗脱并收集蛋白。实验结果表明四个aptamer组合比其它组合富集的蛋白多。随后，我们把表达重组Cathepsin D蛋白的大肠杆菌裂解液直接与磁珠相互作用，结果三个aptamer组合与四个aptamer组合在相同的洗脱条件下具有相近的蛋白捕获效率。利用基于滚环DNA复制的多个aptamer检测Cathepsin D蛋白根据proximity-dependent DNA连接的原理，所有四个aptamer结合Cathepsin D蛋白后能够被连接成环状单链DNA，并且可以使用滚环DNA复制的方法扩增。我们推测根据structure-switch原理设计两臂，使两臂分别与aptamer互补，可以降低背景连接反应。合成四个根据structure-switch原理设计的aptamer进行实验，结果表明Cathepsin D蛋白能够在fM水平促进这四个aptamer连接成环状单链DNA，这样就可以通过滚环DNA复制检测。对照组为只含有三个三肽的重组Cathepsin D蛋白，即使在nM水平也没有得到扩增。表明这个检测体系的背景非常低，并且对Cathepsin D蛋白具有较高的灵敏性和特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 aptamer筛选
• 摘要
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 版图与说明
• 第二章 重组蛋白的克隆和表达
• 摘要
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 版图与说明
• 第三章 aptamer识别蛋白质
• 摘要
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 版图与说明
• 第四章 aptamer捕获蛋白质
• 摘要
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 版图与说明
• 第五章 aptamer检测微量蛋白质
• 摘要
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 版图与说明
• 第六章 文献综述
• 版图与说明
• 参考文献
• 致谢