水稻花药发育控制基因OsADF的功能分析

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是最重要的粮食作物之一。水稻雄性不育与杂种优势的广泛应用在农业生产上发挥了举足轻重的作用。水稻产量和品质的形成与花器官发育直接相关,而花器官发育的分子遗传机制是目前植物发育生物学的研究热点之一。因此,阐明水稻花器官发育的分子遗传机制具有重要意义。生殖发育过程中最重要的器官之一是花药,在花药发育过程中,绒毡层细胞经历一个细胞程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）的过程来促进绒毡层细胞的降解,以期为花粉外壁的形成以及花粉的发育提供必须的营养物质。但绒毡层细胞在整个小孢子发育过程中如何逐渐消亡以及如何参与到小孢子发育的分子机制并不清楚。前期曾分离到一个隐性核基因控制的水稻雄性不育突变体tdr（tapetum degradation retardation）,组织切片、透射电镜等分析结果表明该突变体花药绒毡层降解延迟,小孢子发育异常,最终导致雄性不育。利用图位克隆技术分离到TDR基因,TDR基因编码一个bHLH （basic Helix Loop Helix）转录因子的核蛋白,并通过调控下游基因在水稻花药绒毡层降解和发育过程中发挥重要的作用。目前已利用染色质免疫沉淀技术（ChIP）和ChlP-sequencing方法初步寻找到一批可能受到TDR调节的候选下游基因。其中OsADF基因（LOCOs10g03660）是F-box蛋白家族成员。F-box蛋白是一类含有F-box结构域,在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族。这类蛋白质在细胞循环、信号传导、基因转录、雄性不育和细胞程序性死亡等多种生理过程中发挥重要作用。本研究利用定量ChIP-PCR技术等分析方法对OsADF基因进行分离筛选验证并对其功能及表达模式进行深入研究,主要结果如下：1.定量ChIP-PCR、凝胶迁移率实验（EMSA）结果验证了OsADF基因受TDR直接调控。另外,OsADF本身在tdr突变体中没有表达,利用TDR的启动子在tdr突变体中表达OsADF,结果显示,TDR启动子可以启动OsADF基因的表达,此结果进一步验证TDR对OsADF基因的调控作用。2.生物信息分析结果表明OsADF基因是F-Box蛋白家族。在日本晴中过量表达OsADF基因,获得的阳性转基因植株出现育性下降的表型。通过RNAi干扰技术降低OsADF基因在水稻中的表达水平,可以检测到转基因植株不同程度的出现不育的表型,并且通过半薄切片分析发现花粉发育的后期绒粘层细胞异常膨大,不能进行正常的PCD降解,最终影响花粉发育,从而导致雄性不育,其表型与tdr突变体的表型基本一致。RT-PCR以及qRT-PCR检测结果表明（?）OsADF在干扰植株中表达量明显下降,这一结果说明目的基因的正常表达对水稻花粉的形成起着非常重要的作用。3. RT-PCR、OsADF启动子与报告基因Gus融合表达以及原位杂交结果表明,从花药发育第9期到第12期,OsADF基因在绒毡层和小孢子中特异表达。亚细胞定位研究表明OsADF蛋白定位在细胞膜上,该基因在细胞核中没有表达。以上结果表明,OsADF基因在绒毡层和花药发育过程中起着十分重要的作用。可以推测在某个调控路径中,TDR通过对OsADF基因的调控,影响花药正常发育。这些结果对深入理解绒毡层和花药发育之间的关系具有重要的生物学意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 花药、绒毡层发育的研究概述
• 1.2.1 水稻花药发育的时期
• 1.2.2 花药绒毡层细胞程序性死亡研究进展
• 1.2.3 影响绒毡层发育的关键基因
• 1.2.3.1 拟南芥中影响绒毡层发育的关键基因
• 1.2.3.2 水稻中影响绒毡层发育的关键基因
• 1.3 花药发育相关基因TDR的研究背景
• 1.3.1 花药发育异常tdr突变体的筛选及TDR基因的分离
• 1.3.2 TDR基因下游基因的筛选
• 1.4 水稻F-box蛋白及其生物学功能
• 1.4.1 F-box蛋白的结构
• 1.4.2 F-box蛋白的功能
• 1.4.3 水稻中已有的F-box基因功能报道
• 1.4.4 其它物种中已有的F-box基因功能报道
• 1.4.5 花发育相关的F-box蛋白
• 1.5 本课题的研究目的、意义
• 第二章 OsADF与水稻TDR相互作用关系的验证
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 水稻材料
• 2.2.1.2 菌株
• 2.2.2 试剂和仪器
• 2.2.2.1 试剂
• 2.2.2.2 仪器
• 2.2.3 方法
• 2.2.3.1 ChIP-PCR检验OsADF与TDR的作用关系
• 2.2.3.2 EMSA方法检验OsADF与TDR的作用关系
• 2.2.3.3 TDR promoter-OsADF载体构建
• 2.2.3.4 农杆菌介导的水稻转化操作
• 2.2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.3.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.3.7 RNA的抽提
• 2.2.3.8 RNA反转录cDNA
• 2.2.3.9 qRT-PCR表达水平检测
• 2.2.3.10 水稻总DNA抽提
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 ChIP-PCR验证OsADF与TDR的作用关系
• 2.3.1.1 OsADF启动子序列及其基序（Motifs）分析
• 2.3.1.2 ChIP-qPCR初步验证OsADF受TDR调控
• 2.3.2 EMSA方法验证OsADF与TDR的作用关系
• 2.3.2.1 EMSA探针克隆
• 2.3.2.2 EMSA探针灵敏度检测
• 2.3.2.3 TDR全长蛋白诱导及SDS-PAGE检测
• 2.3.2.4 EMSA进一步验证OsADF受TDR调控
• 2.3.3 OsADF在tdr突变体中的表达分析及表型鉴定
• 2.3.3.1 TDR promoter-OsADF的载体构建及转基因植株的获得
• 2.3.3.2 转基因植株鉴定
• 2.3.3.3 OsADF在tdr突变体中的表达水平
• 2.3.3.4 转基因植株表型观察
• 2.4 讨论
• 第三章 OsADF基因功能研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 野生型材料
• 3.2.1.2 菌株
• 3.2.1.3 表达载体
• 3.2.2 试剂和仪器
• 3.2.2.1 试剂
• 3.2.2.2 仪器
• 3.2.3 方法
• 3.2.3.1 进化树的构建
• 3.2.3.2 水稻总DNA抽提
• 3.2.3.3 水稻组织RNA提取
• 3.2.3.4 T-DNA插入突变体鉴定
• 3.2.3.5 OsADF干扰表达载体构建
• 3.2.3.6 过量表达载体构建
• 3.2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 3.2.3.8 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 3.2.3.9 农杆菌介导的水稻转化操作
• 3.2.3.10 PCR检测转基因植株
• 3.2.3.11 Southern检测转基因植株
• 3.2.3.12 转基因植株表型分析
• 3.2.3.13 半薄切片技术
• 3.2.3.14 半定量RT-PCR
• 3.2.3.15 实时定量RT-PCR实验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 OsADF是F-Box蛋白家族成员
• 3.3.2 突变体基因型和表型鉴定
• 3.3.2.1 突变体插入位点分析
• 3.3.2.2 突变体表型鉴定
• 3.3.3 转基因植株的获得
• 3.3.4 过量转基因株系PCR检测及表型观察
• 3.3.5 OsADF干扰转基因株系PCR检测及表型观察
• 3.3.6 OsADF基因沉默后的表达水平检测
• 3.4 讨论
• 第四章 OsADF基因表达模式分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 水稻材料
• 4.2.1.2 菌株
• 4.2.1.3 表达载体
• 4.2.2 试剂和仪器
• 4.2.2.1 试剂
• 4.2.2.2 仪器
• 4.2.3 方法
• 4.2.3.1 RT-PCR分析
• 4.2.3.2 qRT-PCR实验
• 4.2.3.3 OsADF promoter-GUS载体构建
• 4.2.3.4 部分酶切
• 4.2.3.5 GUS染色
• 4.2.3.6 半薄切片
• 4.2.3.7 振动切片
• 4.2.3.8 原位杂交
• 4.2.3.9 OsADF-YFP载体的构建
• 4.2.3.10 洋葱表皮细胞的瞬时表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 OsADF基因的表达谱分析
• 4.3.2 OsADF基因启动子表达模式分析
• 4.3.3 OsADF基因在花药中的原位杂交分析
• 4.3.3.1 原位探针灵敏度检测
• 4.3.3.2 水稻花药原位杂交结果分析
• 4.3.4 OsADF基因的亚细胞定位分析
• 4.4 讨论
• 第五章 讨论与展望
• 5.1 TDR直接调节OsADF基因的表达来影响绒粘层细胞的PCD进程
• 5.2 OsADF基因可能参与泛素蛋白降解途径调节PCD进程
• 5.3 OsADF基因在水稻花粉发育过程中所处的位置
• 5.4 利用不育基因创制新型不育材料
• 5.5 工作展望
• 参考文献
• 附录1:缩略词英汉对照
• 附录2:主要试剂配方
• 作者简历
• 致谢