RNAi抑制AIV复制及表达抗AIV多靶点miRNA的转基因鼠制备

论文摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）是由A型流感病毒引起的禽类感染疾病综合征,其临床表现包括亚临床感染、中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降和严重的致死性疾病。由H5N1亚型禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）引起的高致病性禽流感是近几年来在许多国家流行、给家禽养殖业带来巨大经济损失的一种烈性传染病、而且威胁到人类的健康和安全。目前主要通过疫苗接种和药物治疗来防控禽流感,但由于禽流感病毒亚型众多、各亚型无交叉保护力、基因组容易发生抗原漂移和抗原转化,使得现有疫苗免疫效果有限。本研究应用RNAi技术和转基因技术,制备表达抗禽流感病毒多靶点miRNA的转基因小鼠,期望获得能够抵抗禽流感病毒的转基因动物,从而为转基因鸡的制备奠定基础,并对抗病毒治疗制剂研究和动物机体抗病毒研究提供依据。本研究首先以H5亚型AIV PB2基因为靶基因,在序列高度保守区设计、化学合成5对siRNA,通过脂质体介导转染MDCK细胞,感染H5N1型AIV,于感染后不同时间收获病毒上清液,通过HA和Real-time PCR试验筛选显著抑制AIV复制的靶位点。但AIV可以通过选择突变来逃避RNAi介导的抗病毒作用,为了抵抗病毒的这种选择突变和逃逸,我们运用多靶点串联策略,选择在禽流感病毒复制与增殖过程中起重要作用的PB2、NP和PA为靶序列,设计miRNA编码序列,克隆入pcDNA6.2-EmGFP-miR载体中,构建单靶点和多靶点串联miRNA表达载体,在细胞水平验证多靶点串联miRNA是否具有协同抑制AIV复制的效果。将多靶点串联miRNA酶切线性化,显微注射入小鼠受精卵的雄原核,将注射后存活的受精卵移植入假孕母鼠体内,对新生小鼠通过基因组DNA PCR、Southern blot和观察GFP表达筛选鉴定整合有目的基因的转基因鼠,转基因鼠通过与正常鼠交配或回交获得各代次转基因小鼠。结果表明在细胞水平筛选到靶向PB2基因、能有效抑制AIV复制的靶位点两个,PB2373和PB2936,也说明PB2在病毒复制中起到重要作用;成功构建了多靶点串联miRNA表达载体,并在细胞水平证明了其协同抑制AIV复制的效果,从而说明多个miRNA串联的策略可能抵抗病毒的选择突变和变异;通过显微注射技术得到转基因鼠,通过基因组DNA PCR、Southern blot和观察GFP表达筛选鉴定出1只G0转基因鼠,通过建系获得8只F1代、35只F2代阳性转基因鼠,从而为在转基因动物水平评价RNAi效果和评价转基因鼠的抗禽流感感染奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 禽流感概述
• 1.1 禽流感的发生与流行
• 1.2 禽流感病毒分子生物学研究进展
• 1.2.1 禽流感病毒的基因组结构及编码蛋白功能
• 1.2.2 禽流感病毒的复制
• 1.2.3 禽流感病毒的遗传与变异
• 1.3 禽流感的免疫预防
• 2 RNAi 研究进展
• 2.1 RNAi 的发现
• 2.2 RNAi 的分子作用机制
• 2.2.1 dsRNA 的产生
• 2.2.2 RNAi 的起始阶段：dsRNA 被加工成siRNA
• 2.2.3 RNAi 的持续阶段或放大阶段
• 2.2.4 RNAi 的效应阶段
• 2.3 RNAi 技术的应用
• 2.3.1 基因治疗
• 2.3.2 新药物的研究和开发
• 2.3.3 基因功能分析
• 2.4 miRNA、siRNA 与RNAi
• 2.5 RNAi 的抗流感病毒研究
• 3 转基因动物研究的概况
• 3.1 常用转基因技术
• 3.1.1 显微注射法
• 3.1.2 逆转录病毒感染法
• 3.1.3 精子载体法
• 3.1.4 胚胎干细胞介导法
• 3.1.5 人工酵母染色体法
• 3.1.6 电转移法
• 3.2 转基因动物的应用
• 3.2.1 动物抗病育种
• 3.2.2 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型
• 3.2.3 生物反应器
• 3.2.4 其他用途
• 3.3 RNAi 在转基因动物中的应用
• 4 研究的目的和意义
• 实验一 靶向P82 基因的特异性SIRNA 抑制禽流感病毒复制
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒与细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 引物
• 1.4 siRNA 设计与合成
• 1.5 siRNA 转染与AIV 接种
• 1.6 HA 试验测定血凝价
• 1.7 Real-time PCR 试验检测P82 转录基因拷贝数
• 1.7.1 标准品的制备及标准曲线的建立
• 1.7.2 Real-time PCR 定量
• 2 结果
• 2.1 HA 试验结果
• 2.2 Real-time PCR 定量结果
• 2.2.1 标准曲线的建立
• 2.2.2 Real-time PCR 定量
• 3 讨论
• 实验二 多靶点串联MIRNA 表达载体的构建及其抑制禽流感病毒复制的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒与细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 引物
• 1.4 miRNA 编码序列的设计与合成
• 1.5 miRNA 单个及串联表达载体的构建与鉴定
• 1.6 细胞培养、重组质粒的转染与禽流感病毒接种
• 1.7 HA 测定血凝价
• 1.8 Real-time PCR 试验检测抑制效果
• 1.8.1 标准品的制备及标准曲线的建立
• 1.8.2 Real-time PCR 定量
• 2 结果
• 2.1 重组质粒鉴定结果
• 2.2 HA 实验结果
• 2.3 Real-time PCR 定量结果
• 2.3.1 标准曲线的建立
• 2.3.2 Real-time PCR 定量
• 3 讨论
• 实验三 表达抗AIV 多靶点MIRNA 转基因鼠的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验用质粒与动物
• 1.2 试剂与仪器设备
• 1.3 引物
• 1.4 显微注射用片段的准备与转基因鼠的制备
• 1.5 G0 代转基因鼠的PCR 鉴定
• 1.6 G0 代转基因鼠的Southern blot 检测
• 1.7 F1 代转基因鼠的获得和检测
• 1.8 转基因鼠的RT-PCR 检测
• 1.9 GFP 表达的检测
• 2 结果
• 2.1 转基因鼠的制备
• 2.2 PCR 检测阳性G0 代鼠
• 2.3 G0 代转基因鼠的Southern blot 检测
• 2.4 F1 代转基因鼠的获得及转基因整合分析
• 2.5 转基因鼠的RT-PCR 检测结果
• 2.6 GFP 表达检测
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介