鸡减蛋综合征病毒河北分离株六邻体蛋白基因的克隆表达及免疫原性研究

论文摘要

本研究主要对减蛋综合征病毒河北分离株（EDSV-HB）的六邻体（Hexon）基因进行了扩增、克隆、测序、表达及免疫原性的研究。参照GeneBank上发表的国际标准株AV-127六邻体（Hexon）基因序列，利用Premer5.0软件设计一对特异性引物。将病毒经鸭胚增殖及PEG沉淀法纯化后，用SDS-蛋白酶K的方法提取出病毒DNA，利用PCR技术扩增六邻体蛋白基因，与pBS-T载体连接后转化TOP10大肠杆菌感受态细胞，经PCR及酶切鉴定筛选出阳性重组子。经测序及序列分析表明，所扩增克隆的基因片段包括了EDSV-HB株Hexon基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA在内的完整序列。将EDSV-HB株Hexon基因序列与EDSV国内外其它参考毒株进行序列比较，分析EDSV-HB株的遗传变异情况，得到如下结果和结论：EDSV-HB株的六邻体蛋白基因全长2733bp，共编码910个氨基酸，与GeneBank上公布的EDSV国际标准株AV-127的长度一致。由系统发育树、EDSV-HB株核苷酸序列及推导出的氨基酸序列可知，EDSV-HB、国际标准株AV-127与中国株AAV-2同属一个分枝，且EDSV各毒株之间六邻体蛋白同源性也极高，均为98.6％以上，但国际标准株AV-127是强毒株，中国株AAV-2则属弱毒株。本研究中，相比较而言EDSV-HB株六邻体蛋白的氨基酸序列与国际标准株AV-127六邻体蛋白的氨基酸序列同源性更高，达99.7％，而与AAV-2同源性为98.6％。中国株AAV-2与国际标准株AV-127六邻体蛋白的氨基酸序列的同源性为98.9％，因此可以得出EDSV-HB株与国际标准株AV-127同为强毒株的结论。EDSV-HB株六邻体基因核苷酸及氨基酸序列与其它哺乳动物及人腺病毒同源性很低，核苷酸同源性为48.4％—78.4％，氨基酸同源性为57.9％—80.9％。另外，与禽腺病毒Ⅰ群病毒代表株Fowl Adenovirus（CELO）的核苷酸同源性为51.8％，氨基酸同源性为78.3％；而与禽腺病毒Ⅱ群病毒代表株HEV（鸡出血性肠炎病毒）的核苷酸同源性也仅为40.5％，氨基酸同源性为69.1％。因此，要将减蛋综合征病毒归入禽腺病毒Ⅲ群。作者将克隆得到的EDSV-HB株Hexon基因亚克隆到pET-32a-c（+）原核表达载体对其进行了表达，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，结果表明Hexon基因在大肠杆菌BL21（DE3）中与6×His一同表达为约110KDa的融合蛋白，且表达产物具有免疫学活性。在研究过程中，作者优化了表达条件后，对重组蛋白进行了大量表达并纯化，用于免疫六周龄非免疫鸡，用间接ELISA方法检测，免疫鸡均产生了较高的抗体水平。由此表明，体外表达的重组蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。为进一步研究减蛋综合征病毒本地分离株的分子生物学特性及六邻体蛋白结构与功能等奠定了基础，也为研究EDS基因工程疫苗创造了条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒及抗体
• 2.1.2 试验用鸡
• 2.1.3 菌种与质粒载体
• 2.1.4 试验所需酶及主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 试验所需主要溶液及其配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 病毒的增殖
• 2.2.3 病毒基因组的提取
• 2.2.4 PCR扩增EDSV Hexon基因
• 2.2.5 PCR产物的凝胶回收纯化
• 2.2.6 PCR产物的克隆
• 2.2.7 重组克隆载体的鉴定
• 2.2.8 目的基因的序列测定及序列分析
• 2.2.9 目的基因原核表达载体的构建
• 2.2.10 阳性克隆的筛选及鉴定
• 2.2.11 Hexon基因的表达
• 2.2.12 重组蛋白表达条件的优化
• 2.2.13 重组蛋白的大量表达
• 2.2.14 表达蛋白溶解性的判定
• 2.2.15 从包涵体中纯化表达蛋白
• 2.2.16 表达重组蛋白的动物免疫
• 2.2.17 间接ELISA方法检测免疫鸡抗体水平
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡EDSV-HB株Hexon基因的PCR扩增
• 3.2 PCR方法鉴定阳性克隆
• 3.3 重组质粒测序鉴定及遗传变异分析
• 3.4 重组表达质粒pET-H的酶切鉴定
• 3.5 重组蛋白的表达
• 3.6 Western-blotting鉴定分析
• 3.7 不同诱导温度对重组蛋白表达量的影响
• 3.8 不同诱导时间对重组蛋白表达量的影响
• 3.9 不同IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响
• 3.10 表达蛋白的溶解性判定试验
• 3.11 表达蛋白的纯化
• 3.12 间接ELISA方法检测重组蛋白免疫试验鸡后抗体水平
• 3.12.1 重组蛋白抗原最适包被浓度的确定
• 3.12.2 免疫鸡抗重组蛋白血清效价的检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 作者简介
• 致谢
• 附发表文章