喜树内生真菌产喜树碱及生物活性的研究

论文摘要

本研究以安徽境内喜树为研究对象,通过对喜树内生真菌的分离、筛选、发酵条件以及代谢产物喜树碱提取工艺的摸索等方面的研究,对微生物发酵法产抗癌药物喜树碱及新型抗癌抗菌药物进行探索研究。从安徽合肥、宣城和黄山等地采集喜树的根、枝、叶、果实、树皮,分离获得197株内生真菌。并利用薄层层析（TLC）方法对197株内生真菌的液体发酵培养物进行了初筛,选筛出13株可产喜树碱或其类似物的菌株。再通过高效液相色谱（HPLC）对其作了进一步分析,发现有1株内生真菌菌株发酵代谢物的吸收峰与喜树碱标准品吸收峰保留时间一致,此菌株编号为LR051。通过液体培养基组成成分的正交试验,以喜树碱含量为指标,比较不同的营养性因素包括碳氮源、无机盐及非营养因素温度对喜树碱产量的影响。最终筛选出LR051菌株的最适液体培养基的组成为:葡萄糖2%、马铃薯20%、蛋白胨0.5%、MgSO4·7H2O 0.2%、CaCl20.1%、MnSO4·H2O 0.006%。通过比较不同提取方法的提取处理及相关理化试验,确定了活性物质的最佳的提取工艺为:47℃条件下浓缩发酵液至原体积的1/5,加3倍体积95%乙醇（乙醇终浓度为70%）醇沉,除去沉淀并脱醇后,以氯仿为萃取剂,按2:1的体积比分两次萃取,合并脂溶相,浓缩至原脂溶相体积的1/10,即得到喜树碱活性物质的粗提品。喜树碱活性物质的粗提品经过硅胶柱分离纯化后结合TLC技术与HPLC-MS技术得到喜树碱纯品,该化合物的分子式为C20H16N2O4,分子量为348,名称为4-乙基-4-羟基-1H-吡喃[3′,4′:6,7]氮茚[1,2]喹啉-3,14（4H,12H）-二酮。在197株供试菌株中,共有46株对CHO细胞有抑制作用,占总供试菌株的23.4%,从树皮中分离出的内生真菌具有抗肿瘤活性的比例最高,达到45.0%;枝次之,为40.6%;而叶最低仍可达到8.7%。不同地理来源所采集分离的菌株,其代谢产物抗肿瘤活性存在着显著差异,表现为安徽黄山采集分离的菌株抗肿瘤活性菌株所占比例最高,达到42.9%,安徽宣城次之为35.6%,安徽合肥最低仅为25.9%。得自黄山采集地的一株菌株LR126对CHO细胞的抑制率超过了50%,对宫颈癌Hela细胞系抑制率超过了90%,此菌株从喜树果实中分离。因该活性菌株在培养基上无明显产孢结构,故采用分子分类法鉴定其种类。经测序发现该菌株（Accession numbers是EU250374）与GenBank数据库所登陆的Rhizopycnis vagum的ITS区相似率为95%,故可初步判断该菌株为根盘菌属（Rhizopycnis sp.）真菌。抗肿瘤实验结果中,选取20株细胞毒性较高的菌株进一步进行抗菌实验,期待从中选出一株在抗肿瘤和抗菌两方面都表现出优良特性的菌株,同时探索菌株在抗肿瘤和抗菌活性高低方面是否存在相关性。分析实验结果可以发现,35.0%的菌株对供试的四种靶标菌的生长同时具有抑制作用。这表明:喜树内生真菌代谢产物是筛选生物活性物质的一个很好的来源。菌株LR004液体发酵产物具有较高的抗菌活性,对小麦纹枯、油菜菌核、辣椒疫霉、苹果炭疽四种指示菌的生长抑制明显优于其它菌株。稳定性测试的结果显示:LR004菌株热稳定性、光稳定性和贮藏稳定性较好,而pH稳定性稍差。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 4 结果与分析
• 4.1 内生真菌分离结果
• 4.1.1 不同部位内生真菌的分离
• 4.1.2 不同地理来源内生真菌的分离
• 4.2 喜树碱产生菌的筛选
• 4.2.1 内生真菌的液体培养及代谢产物的提取
• 4.2.2 利用薄层分析（TLC）进行产物的初步分析
• 4.2.3 利用高效液相色谱法分析（HPLC）作进一步分析
• 4.3 LR051菌株发酵条件的研究
• 4.3.1 营养性因素对LR051菌株产喜树碱量的影响
• 4.3.2 培养基优化前后对喜树碱产生的影响
• 4.4 代谢产物喜树碱的提取工艺
• 4.4.1 菌丝体与大分子杂质的去除
• 4.4.2 最佳萃取试剂的选择
• 4.4.3 最佳萃取体积比的选择
• 4.4.4 最佳萃取次数的确定
• 4.4.5 LR051代谢产物喜树碱的最佳提取方案流程
• 4.5 LR051代谢产物的分离纯化
• 4.5.1 30 L发酵罐生产
• 4.5.2 喜树碱粗样硅胶柱层析
• 4.5.3 喜树碱样品纯度的鉴定
• 4.6 细胞毒性实验方法的优化
• 4.6.1 不同细胞浓度对喜树碱抗肿瘤活性的影响
• 4.6.2 不同作用时间对喜树碱抗肿瘤活性的影响
• 4.7 以抗肿瘤活性为指标的菌株筛选
• 4.7.1 活性菌株的初筛实验
• 4.7.2 活性菌株的复筛实验
• 4.7.3 复筛后的菌株对Hela细胞作用实验
• 4.7.4 高抗肿瘤活性菌株LR126的分类鉴定
• 4.8 以抗菌活性为指标的菌株筛选
• 4.8.1 20株内生真菌对小麦纹枯的生长抑制
• 4.8.2 7株内生真菌对四种病原真菌的生长抑制
• 4.8.3 活性菌株LR004对植物病原菌油菜菌核的菌丝生长抑制
• 4.8.4 活性菌株LR004稳定性测试
• 讨论
• 1、药用植物喜树的选择
• 2、内生真菌分离培养以及菌株鉴定中存在的问题
• 3、喜树内生真菌与喜树碱
• 4、提高内生真菌产喜树碱产量的途径
• 5、菌株LR051代谢产物中喜树碱的提取工艺
• 6、菌株LR051代谢产物中喜树碱的分离纯化鉴定
• 7、细胞毒性试验方法
• 8、抗肿瘤实验
• 9、抑菌实验
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 发表的学术论文目录