山羊表皮干细胞分离纯化的研究

论文摘要

表皮干细胞（epidermal stem cells,EpiSCs）是具有无限增殖潜能、通过对称或不对称分裂方式自我更新并不断产生功能性细胞以维持表皮稳态的一个细胞群。EpiSCs定位于两个部位:表皮基底层和毛囊隆突。正是表皮干细胞的内在属性和微环境的外部刺激维持了EpiSCs的干细胞特性。近年来,EpiSCs在皮肤创伤愈合、构建人工皮肤、细胞治疗上都显示出巨大的应用潜力。应用于临床的第一个重要的步骤是分离出能在体外大量扩增的干细胞群作为种子细胞。本试验的目的就是为了获得具有长期更新能力的山羊EpiSCs,并检测EpiSCs 的相关特性,为下一步的组织工程研究提供种子细胞。本试验内容如下。1. 组织块法分离EpiSCs。对关中奶山羊皮肤消毒处理后,器械法分离表皮和真皮。将表皮分别干置5 min,10 min,20 min,30 min,以确定最佳贴壁效果。结果20 min贴壁率最好, 90.00±0.0816%。表皮贴壁后细胞呈铺路石样生长,并有PGCs 样细胞团出现。原代细胞在含20%血清+5 μg/mL 胰岛素+0.5 μg/mL 氢化可的松的培养的M199中培养,待细胞汇合后用0.25%胰酶传代,传代后细胞用含0.1%BSA+20%条件培养基+5 μg/mL 胰岛素+0.5 μg/mL 氢化可的松+20 ng/mL EGF 的M199 培养。本试验统计组织块法分离细胞的相关数据,结果发现组织块法分离细胞效率较低:原代细胞迁移时间,4.9±1.5d; 原代细胞传代时间, 16.4±5.7d; 传代次数, 3.8±1.5。2. 酶消化法分离EpiSCs。结合Dispase酶和胰酶对组织块进行处理,分离出表皮后,用IV型胶原快速粘附法分离EpiSCs,分别选择5 min,10 min,20 min,60 min进行筛选,以确定最佳时间。结果以10 min筛选细胞比例最为合适,约为10.8%。筛选出的细胞在10%血清+5 μg/mL胰岛素+0.5 μg/mL氢化可的松+20 ng/mL EGF的D/F中培养,细胞呈片状克隆生长,最后汇合形成镶嵌多角形的表皮细胞层。4 天左右即可观察到克隆出现,10 天左右1 代细胞可传代,最高传代数10 代。将上述两种方法所得到的原代传代时间和传代数数据进行比较分析,差异极显著。从而认为酶消化法分离表皮干细胞具有比组织块法更高的效率。3. 条件培养基（conditioned medium, CM）和EGF 对EpiSCs 生长的影响。设CM实验组浓度为50%、20%,对照组为0%。用MTT法测量各组细胞的生长曲线,并比较各组OD 值之间的差异。结果表明,实验组同对照组有显著性差异,两个实验组浓度也存在显著差异,说明CM 对EpiSCs 生长有显著促进作用。用相同的方法测量EGF 对

论文目录

• 文献综述
• 第一章 表皮干细胞的定位
• 1.1 表皮基底层的结构及表皮增殖单位
• 1.2 毛囊及其隆突
• 1.3 小结
• 第二章 微环境与表皮干细胞
• 2.1 表皮基底层
• 2.1.1 基膜
• 2.1.2 整合素
• 2.2 毛囊隆突部
• 2.2.1 隆突部细胞及其邻近细胞
• 2.3 干细胞定位的维持
• 2.4 干细胞不对称分裂的调节
• 2.5 小结
• 第三章 表皮干细胞的特性及其鉴定
• 3.1 慢周期性
• 3.2 自我更新能力
• 3.3 粘附特性
• 3.4 可塑性
• 3.5 表皮干细胞的形态结构特征
• 3.6 其它鉴定手段
• 3.6.1 K19
• 3.6.2 K15
• 3.6.3 P63
• 3.6.4 与增殖相关的标记物
• 实验研究
• 第四章 山羊表皮干细胞分离纯化及培养
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 试验动物
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.1.3 培养液
• 4.1.1.4 消化液
• 4.1.1.5 条件培养基
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 组织块法分离纯化表皮干细胞
• 4.1.2.2 酶消化法分离纯化表皮干细胞
• 4.1.2.3 表皮干细胞的传代培养
• 4.1.2.4 生长曲线
• 4.1.2.5 条件培养基对EpiSCs生长的影响
• 4.1.2.6 EGF对表皮干细胞生长的影响
• 4.1.2.7 EpiSCs克隆形成率的测定
• 4.1.2.8 透射电镜分析
• 4.1.2.9 免疫组化染色鉴定
• 4.1.2.10 冷冻与解冻
• 4.1.2.11 统计分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 分离纯化
• 4.2.2 EpiSCs的生长行为
• 4.2.2.1 组织块法分离的EpiSCs生长行为
• 4.2.2.2 酶消化法分离EpiSCs的生长行为
• 4.2.3 EpiSCs生长曲线的测定
• 4.2.4 不同浓度条件培养基对表皮干细胞生长的影响
• 4.2.5 不同浓度EGF对表皮干细胞生长的影响
• 4.2.6 CFE分析
• 4.2.7 电镜分析
• 4.2.8 免疫组化分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 EpiSCs的分离
• 4.3.2 EpiSCs鉴定
• 4.3.3 EpiSCs的数量
• 4.3.4 条件培养基和EGF对EpiSCs的影响
• 结论
• 参考文献
• 致 谢
• 个人简介