乳杆菌生物合成苯乳酸的研究

论文摘要

苯乳酸（phenyllactic acid,PLA）是乳酸菌产生的一种新型抑菌物质,它不仅能够抑制多种食源性致病菌,而且对引起食品腐败的真菌具有广泛的作用。此外,苯乳酸稳定性高,安全无毒,有望开发成一种新型生物防腐剂应用于食品工业。国外对苯乳酸的研究尚处于初始阶段（1998-2008）,存在诸如乳酸菌种产量低、底物成本高和发酵时间长等问题。本文在国内率先对乳酸菌合成苯乳酸进行了系统的研究,主要内容包括:筛选高产苯乳酸的乳酸菌;研究其产生苯乳酸的途径和机理;优化乳酸菌生长细胞产生苯乳酸的发酵条件;研究影响乳酸菌静息细胞合成苯乳酸的因素;乳酸菌合成苯乳酸的酶进行分离、纯化并研究其酶学性质。利用MRS培养基发酵和HPLC检测,从中国传统发酵食品——泡菜中分离出一株高产苯乳酸的乳酸菌菌株,30℃培养72 h最高可产生91.3 mg/L的苯乳酸。通过形态学、生理生化及16S rDNA,初步鉴定为乳杆菌,命名为Lactobacillus sp.SK007,GenBankaccession number:DQ534529。系统发育分析表明,和植物乳杆菌亲缘关系最近。研究利用苯丙氨酸途径合成苯乳酸,提高苯丙氨酸的浓度可以增加苯乳酸的产量。以1.5g/L苯丙氨酸为底物的转化过程中发现:发酵72 h苯乳酸达到最高,而此时苯丙氨酸剩余94%、检测不到中间产物苯丙酮酸,这表明转氨反应是苯乳酸合成的限速步骤。进一步对影响转氨反应的因素进行研究,确定氨基受体α-酮戊二酸的缺乏是主要因素。研究了通过促进转氨反应提高苯乳酸的途径,分别采用添加α-酮戊二酸、谷氨酸以及柠檬酸和谷氨酸,苯乳酸产量有一定提高。苯丙氨酸的转氨反应已成为苯乳酸合成的瓶颈。在此基础上,使用苯丙酮酸替代同浓度的苯丙氨酸作为底物合成苯乳酸,结果苯乳酸产量提高了11倍、发酵时间缩短了48 h、原料成本降低了2/3。这表明,以苯丙酮酸为底物是苯乳酸合成的有利途径,为规模化生产提供了可能性。对乳杆菌的发酵条件进行了优化,用廉价的玉米浆代替昂贵的蛋白胨作为氮源。利用响应面法对培养基成分进行了优化,得到的培养基成分（g/L）:为葡萄糖30,玉米浆47,酵母粉5,磷酸氢二钟3,醋酸钠5,柠檬酸三铵2,硫酸镁0.58,硫酸锰0.25,吐温-80 3 mL,苯丙酮酸5。最适的培养温度30℃、接种量3%、静置培养。发酵过程中pH变化对苯乳酸影响很大,可采用添加0.5%的缓冲盐及中和剂进行内源调节。在发酵罐中,采用后期流加碱液控制pH的方法有利于苯乳酸合成。在此基础上进行了300 L发酵罐中试,苯乳酸产量达到2.81 g/L。利用乳酸菌静息细胞也可以合成苯乳酸,HPLC分析了静息细胞内、外的苯乳酸含量,结果表明绝大部分苯乳酸释放到转化液中。研究了细胞浓度、底物浓度、表面活性剂以及环境因素对苯乳酸产生的影响,得到的转化条件为:菌体静置培养24 h、用pH6.0的缓冲液收获细胞调节浓度为20g/L,加入2g/L苯丙酮酸,35℃、120 rpm反应2 h,苯乳酸产量可达0.98 g/L。静息细胞重复利用实验表明:第二次使用时,细胞活力仅为首次使用的20%,第三次已没有苯乳酸产生。进一步研究表明还原型辅酶NADH的缺乏是主要影响因素。针对反应过程中辅酶缺乏这一问题,构建了基于辅助底物的酶法再生体系。研究了葡萄糖、乙醇等辅助底物对苯乳酸合成的影响,确定葡萄糖是最适的辅助底物。在添加1%的葡萄糖,细胞重复利用5次活力仍能保持80%,细胞冷藏10天仍有60%的活力。经过超声波破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱和AKTAExplore Sephacryl S-200凝胶过滤等分离步骤,纯化得到乳酸脱氢酶（LDH）,SDS-PAGE呈现单一条带,HPLC检测纯度达98%。比酶活提高34.29倍、达到203.30 U/mg,回收率19.27%。在各纯化步骤中,该酶作用丙酮酸和苯丙酮酸的比值恒定,说明此酶是将苯丙酮酸还原成苯乳酸的主要酶。由SDS-PAGE得到LDH相对分子质量为39 kDa,而凝胶过滤色谱求得LDH的相对分子量约为80 kDa,因此,推断乳杆菌LDH分子内有2个亚基,是一种二聚体酶。圆二色性分析表明,LDH二级结构中α-旋占14.9、β-折叠35.7%、回转结构由为28.6%、无规卷曲为20.8。纯化的LDH作用苯丙酮酸的最适作用温度是40℃,超过60℃迅速下降;最适pH值为6.0、在4-8之间保持稳定;Mg2+、Mn2+对酶活力有促进作用,Cu2+、Hg2+对酶活力有不同程度的抑制作用。LDH对丙酮酸和苯丙酮酸的亲和力差别很大。采用Lineweaver-Burk法作图法,求得LDH作用丙酮酸和苯丙酮酸的米氏常数Km分别为0.31、1.69 mM。对10株乳杆菌的乳酸脱氢酶活力与其合成苯乳酸的能力进行了初步探讨,结果表明乳杆菌之间LDH对丙酮酸和苯丙酮酸的差别很大,对苯丙酮酸高的LDH乳杆菌产生了高的苯乳酸含量。因此,乳酸脱氢酶的活力可以作为筛选乳酸菌产生苯乳酸的标准之

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略符号表
• 第一章 绪论
• 1.1 苯乳酸的功能性质
• 1.1.1 苯乳酸的理化性质
• 1.1.1.1 结构
• 1.1.1.2 溶解度和稳定性
• 1.1.2 苯乳酸的抑菌性能
• 1.1.2.1 苯乳酸抑菌活性的发现
• 1.1.2.2 抑菌谱
• 1.1.2.3 作用机制
• 1.1.2.4 安全性
• 1.1.3 苯乳酸的减毒作用
• 1.1.4 苯乳酸的药理作用
• 1.2 苯乳酸的应用
• 1.2.1 苯乳酸在食品中的应用
• 1.2.1.1 乳品工业
• 1.2.1.2 焙烤工业
• 1.2.2 苯乳酸在医药中的应用
• 1.2.2.1 作为丹参素替代品,用于冠心病的临床治疗
• 1.2.2.2 作为带节育器出血的治疗药物
• 1.2.2.3 用于合成降血糖制剂Englitazone
• 1.2.3 化妆品工业
• 1.3 苯乳酸的制备
• 1.3.1 苯乳酸在自然界的分布
• 1.3.2 苯乳酸的化学合成
• 1.3.3 苯乳酸的生物合成
• 1.3.3.1 苯乳酸的产生菌
• 1.3.3.2 乳酸菌合成苯乳酸的国内外研究进展
• 1.3.3.3 苯乳酸的生物合成途经
• 1.3.4 苯乳酸合成涉及的酶类
• 1.3.4.1 转氨反应
• 1.3.4.2 还原反应
• 1.4 苯乳酸的检测
• 1.4.1 TLC（薄层层析）法
• 1.4.2 HPLC（高效液相色谱）法
• 1.5 立题背景和意义
• 1.6 本课题的研究内容
• 参考文献
• 第二章 苯乳酸高产菌株分离、筛选及初步鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 试验仪器
• 2.2.3 主要实验方法
• 2.2.3.1 样品采集
• 2.2.3.2 培养基
• 2.2.3.3 菌种分离、纯化
• 2.2.3.4 初筛、复筛方法
• 2.2.3.5 HPLC测定发酵液中的苯乳酸
• 2.2.3.6 菌株形态观察
• 2.2.3.7 生理、生化鉴定
• 2.2.3.8 菌株16S rDNA序列测定、分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产苯乳酸的乳酸菌菌株分离、筛选结果
• 2.3.1.1 菌种初筛
• 2.3.1.2 菌种复筛
• 2.3.1.3 产苯乳酸的乳酸菌菌株比较
• 2.3.2 菌株B7在MRS培养基中合成苯乳酸的过程
• 2.3.3 高产菌株的初步鉴定
• 2.3.3.1 菌株形态特征观察
• 2.3.3.2 生理、生化实验
• 2.3.3.3 16S rDNA序列测定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Lactobacillus sp.SK007合成苯乳酸的机理研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验材料
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.1.2 菌种
• 3.2.1.3 培养基
• 3.2.2 试验仪器
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 培养方法
• 3.2.3.2 分析方法
• 3.2.3.3 苯丙氨酸浓度对苯乳酸合成的影响
• 3.2.3.4 乳杆菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的发酵过程
• 3.2.3.5 辅酶磷酸吡哆醛对乳杆菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的影响
• 3.2.3.6 氨基供体对乳杆菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的影响
• 3.2.3.7 谷氨酸对乳杆菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的影响
• 3.2.3.8 谷氨酸和柠檬酸的协同效应对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 3.2.3.9 苯丙酮酸代替苯丙氨酸合成苯乳酸
• 3.2.3.10 苯丙酮酸浓度对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 3.2.3.11 不同底物形式合成苯乳酸的效果
• 3.2.3.12 乳杆菌利用苯丙酮酸合成苯乳酸的时间过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 乳杆菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的研究
• 3.3.1.1 苯丙氨酸浓度对Lactobacillus sp.SK007合成苯乳酸的影响
• 3.3.1.2 Lactobacillus sp.SK007利用苯丙氨酸合成苯乳酸过程
• 3.3.2 苯丙氨酸转氨反应的影响因素及促进方法
• 3.3.2.1 影响苯丙氨酸转氨反应的因素
• 3.3.2.2 通过促进转氨反应提高苯乳酸的产量
• 3.3.3 乳杆菌利用苯丙酮酸合成苯乳酸的研究
• 3.3.3.1 苯丙酮酸对Lactobacillus sp.SK007合成苯乳酸的影响
• 3.3.3.2 底物浓度对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 3.3.3.3 底物存在形式对Lactobacillus sp.SK007产生苯乳酸的影响
• 3.3.3.4 乳酸菌利用苯丙酮酸合成苯乳酸的时间过程
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 乳杆菌合成苯乳酸发酵条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.1.1 试剂
• 4.2.1.2 菌种
• 4.2.1.3 培养基
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 培养方法
• 4.2.3.2 分析方法
• 4.2.3.3 培养基成分的优化
• 4.2.3.4 培养条件的优化
• 4.2.3.5 发酵罐放大试验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 碳源对苯乳酸合成的影响
• 4.3.2 氮源对苯乳酸合成的影响
• 4.3.3 吐温-80对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 4.3.4 响应面法优化培养基
• 4.3.5 发酵条件的优化
• 4.3.5.1 培养温度对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 4.3.5.2 pH对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 4.3.5.3 转速对乳杆菌合成苯乳酸的影响
• 4.3.5.4 接种量对Lactobacillus sp.SK007产生苯乳酸的影响
• 4.3.6 发酵罐放大试验
• 4.3.6.1 30L发酵罐放大试验
• 4.3.6.2 300L发酵罐放大试验
• 4.3.7 乳杆菌与其它微生物生物合成苯乳酸产量的比较
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 乳酸菌静息细胞合成苯乳酸以及辅酶再生的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂与材料
• 5.2.1.1 试剂
• 5.2.1.2 菌种
• 5.2.1.3 培养基
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 菌种活化、培养
• 5.2.3.2 静息细胞的制备
• 5.2.3.3 静息细胞转化方法
• 5.2.3.4 检测方法
• 5.2.3.5 苯乳酸合成后的分布
• 5.2.3.6 底物浓度对苯乳酸合成的影响
• 5.2.3.7 细胞浓度对PLA合成的影响
• 5.2.3.8 表面活性剂对PLA合成的影响
• 5.2.3.9 缓冲液及pH对PLA合成的影响
• 5.2.3.10 温度对PLA合成的影响
• 5.2.3.11 转速对PLA合成的影响
• 5.2.3.12 乳杆菌静息细胞重复利用实验
• 5.2.3.13 重复利用细胞的粗酶液制备
• 5.2.3.14 外加辅酶对苯乳酸合成的影响
• 5.2.3.15 辅助底物对苯乳酸合成的影响
• 5.2.3.16 葡萄糖对乳酸菌静息细胞重复利用及冷藏稳定性的影响
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 乳酸菌静息细胞转化产物及苯丙酮酸的代谢途径
• 5.3.2 影响乳酸菌静息细胞合成苯乳酸的因素
• 5.3.2.1 培养时间对静息细胞合成苯乳酸的影响
• 5.3.2.2 苯丙酮酸浓度对乳杆菌静止细胞合成苯乳酸的影响
• 5.3.2.3 细胞浓度对静息细胞合成苯乳酸的影响
• 5.3.2.4 表面活性剂对Lactobacillus sp.SK007转化的影响
• 5.3.2.5 转化液pH对苯乳酸生成的影响
• 5.3.2.6 温度对苯乳酸合成的影响
• 5.3.3 辅酶再生对乳酸菌静息细胞催化稳定性的影响
• 5.3.3.1 静息细胞重复利用试验
• 5.3.3.2 外加辅酶对苯乳酸合成的影响
• 5.3.3.3 构建基于辅助底物的辅酶再生体系
• 5.3.3.4 以葡萄糖为辅助底物对静息细胞催化稳定性的影响
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 乳杆菌乳酸脱氢酶的分离、纯化及酶学性质的研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要实验材料
• 6.2.1.1 试剂
• 6.2.1.2 菌种及保藏方法
• 6.2.2 主要实验仪器
• 6.2.3 实验方法
• 6.2.3.1 酶的提取及分离纯化过程
• 6.2.3.2 分析方法
• 6.2.3.3 酶的产生及收集
• 6.2.3.4 粗酶液的制备
• 6.2.3.5 硫酸铵沉淀
• 6.2.3.6 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析
• 6.2.3.7 AKTA Explore 3000 Sephacryl S-200凝胶过滤
• 18-HPLC鉴定酶的纯度'>6.2.3.8 SDS-PAGE电泳、RPC₁₈-HPLC鉴定酶的纯度
• 6.2.3.9 乳酸脱氢酶分子量及亚基分子量测定
• 6.2.3.10 纯酶的圆二色性（CD）测定
• 6.2.3.11 氨基酸组成分析
• 6.2.3.12 温度对酶活力及稳定性的影响
• 6.2.3.13 pH对酶活力及稳定性的影响
• 6.2.3.14 金属离子对酶活力的影响
• m'>6.2.3.15 确定丙酮酸、PPA的K_m
• 6.2.3.16 乳酸菌的乳酸脱氢酶活力和其合成笨乳酸能力的测定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 酶的分离、纯化
• 6.3.1.1 硫酸铵盐析
• 6.3.1.2 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱
• 6.3.1.3 Sephacryl S-200凝胶过滤
• 6.3.1.4 纯化结果
• 6.3.2 酶的性质研究
• 6.3.2.1 LDH分子量及亚基分子量的测定
• 6.3.2.2 LDH的圆二色性
• 6.3.2.3 LDH的氨基酸组成分析
• 6.3.3 LDH的酶学性质
• 6.3.3.1 温度对酶活力及稳定性的影响
• 6.3.3.2 pH对酶活力及稳定性的影响
• 6.3.3.3 金属离子对酶活力的影响
• 6.3.3.4 LDH对丙酮酸、PPA的Km
• 6.3.4 乳杆菌的LDH活力与其产苯乳酸能力的关系
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 论文创新点
• 博士期间发表的论文成果
• 致谢