富勒烯的DNA损伤机制及毒性效应研究

论文摘要

纳米材料的生物毒性效应日益受到广泛的关注，通过研究C60的DNA损伤机理及相关生物效应，探讨C60与生物体的相互作用方式及潜在致毒机制，以期建立评估纳米材料生物安全性的研究方法和体系。实验结果表明，C60可在常温避光条件下降解质粒pBR322，DNA降解效应与反应温度、反应时间和C60浓度相关。化学发光法检测反应体系产生中的超氧阴离子同样与反应温度、反应时间和C60浓度相关。SOD酶作为氧自由基淬灭剂可以抑制C60诱导的DNA剪切效应并且淬灭C60产生的超氧阴离子。上述结果表明，C60在常温非光照条件下产生超氧阴离子是导致DNA剪切效应的主要原因。当甲酰胺或其它含有酰胺基团的有机物与C60共同反应时或增加反应体系中离子强度，C60的DNA降解效应被显著的抑制，由此推测DNA构象的稳定性以及C60的表面性质是DNA降解效应的另一重要因素。SYBR GREENⅠ染料竞争结合实验表明C60可结合到DNA上，并影响DNA的构象。综上所述：C60可通过结合到DNA上，降低DNA构象稳定性，诱导活性氧的产生，造成DNA损伤。以PCR反应作为体外研究模型，模拟DNA复制过程，合成单链DNA模板，研究C60对PCR的影响，探讨C60潜在的基因毒性。实验结果表明，随着C60浓度的增加，PCR反应被显著抑制；将Taq DNA聚合酶、单链DNA模板与C60孵育后，其PCR扩增产物均显著减少；增加PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶量，可消除C60的抑制作用，但增加起始模板单链DNA的量，PCR产物的量变化不明显。上述研究结果说明C60不仅可抑制Taq DNA聚合酶活性，同时对单链DNA模板也具有一定的损伤作用。细胞毒性实验结果表明，C60对人胃癌细胞SGC-7901和人胚肾细胞HEK-293的细胞活力无明显影响，对CYP1A1基因的表达亦无明显效应。C60的抑菌实验结果表明：C60可显著抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和根癌农杆菌的生长，具有明显的时间、剂量-效应关系；但相对根癌农杆菌，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌可从C60所造成的抑制状态恢复到正常状态，这可能与C60的抑菌机制以及菌株耐受能力相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题研究的背景和意义
• 1.2 纳米材料的性质和毒性效应
• 1.2.1 纳米材料的性质
• 1.2.2 纳米材料的毒性效应
• 1.3 富勒烯的性质及生物学效应
• 1.3.1 富勒烯的理化性质
• 1.3.2 富勒烯与生物体的氧化应激效应
• 1.3.3 富勒烯与蛋白质、DNA的生物学效应
• 2 材料与方法
• 60的溶解'>2.1 C₆₀的溶解
• 2.1.1 实验材料和仪器
• 2.1.2 实验步骤
• 60透射电镜检测'>2.2 水溶性C₆₀透射电镜检测
• 2.2.1 实验材料和仪器
• 2.2.2 实验步骤
• 60与DNA共孵育实验'>2.3 水溶性C₆₀与DNA共孵育实验
• 2.3.1 实验材料和仪器
• 2.3.2 孵育实验步骤
• 2.3.3 DNA变性条件实验步骤
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.1 实验材料和仪器
• 2.4.2 实验步骤
• 2.5 氧自由基的检测
• 2.5.1 实验材料和仪器
• 2.5.2 超氧阴离子检测步骤
• 2.6 SYBR GREEN Ⅰ染料竞争结合实验
• 2.6.1 实验材料和仪器
• 2.6.2 实验步骤
• 60抑制PCR反应实验'>2.7 C₆₀抑制PCR反应实验
• 2.7.1 实验材料和仪器
• 60对PCR反应的影响'>2.7.2 C₆₀对PCR反应的影响
• 60对Taq DNA聚合酶活性的影响'>2.7.3 C₆₀对Taq DNA聚合酶活性的影响
• 60对单链DNA模板的影响'>2.7.4 C₆₀对单链DNA模板的影响
• 60动物细胞毒性实验'>2.8 水溶性C₆₀动物细胞毒性实验
• 2.8.1 实验材料和仪器
• 2.8.2 细胞培养
• 2.8.3 MTT法测定细胞活力
• 2.8.4 CYP1A1基因半定量分析
• 60暴露细菌期间生长曲线的测定'>2.9 C₆₀暴露细菌期间生长曲线的测定
• 2.9.1 实验材料和仪器
• 2.9.2 实验步骤
• 3.0 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 60形态分析'>3.1 水溶性C₆₀形态分析
• 60的热催化效应降解DNA'>3.2 C₆₀的热催化效应降解DNA
• 60与DNA共孵育的DNA剪切效应'>3.2.1 水溶性C₆₀与DNA共孵育的DNA剪切效应
• 3.2.2 共孵育条件DNA降解的抑制效应
• 60降解DNA的效应'>3.2.3 变性条件水溶性C₆₀降解DNA的效应
• 3.2.4 变性条件酰胺类化合物抑制DNA降解的效应
• 3.2.5 变性条件离子化合物抑制DNA降解的效应
• 60产生氧自由基的研究'>3.3 C₆₀产生氧自由基的研究
• 60产生的氧自由基'>3.3.1 化学发光法检测水溶性C₆₀产生的氧自由基
• 3.3.2 SOD酶和甲酰胺对产生氧自由基的抑制效应
• 60竞争结合DNA的作用'>3.4 SYBR GREEN Ⅰ染料与C₆₀竞争结合DNA的作用
• 60对PCR反应的抑制作用'>3.5 C₆₀对PCR反应的抑制作用
• 60对PCR反应的影响'>3.5.1 水溶性C₆₀对PCR反应的影响
• 60对Taq DNA聚合酶的抑制作用'>3.5.2 水溶性C₆₀对Taq DNA聚合酶的抑制作用
• 60对DNA模板的损伤作用'>3.5.3 水溶性C₆₀对DNA模板的损伤作用
• 60的离体生物毒性效应'>3.6 C₆₀的离体生物毒性效应
• 60对动物细胞的活力影响'>3.6.1 水溶性C₆₀对动物细胞的活力影响
• 60对细菌的毒性'>3.6.2 水溶性C₆₀对细菌的毒性
• 4 讨论
• 60降解DNA的机制'>4.1 水溶性C₆₀降解DNA的机制
• 4.2 离子化合物和酰胺类化合物抑制DNA降解的机制
• 60抑制PCR反应的机理'>4.3 C₆₀抑制PCR反应的机理
• 4.4 富勒烯的离体毒性效应
• 4.5 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢