苯磺隆诱导烟草愈伤组织抗药性产生机理的初步研究

论文摘要

随着除草剂使用量的大幅度提高,杂草的抗药性问题也越来越突出,这已引起了许多领域科学家的极大关注。目前国际上已经把杂草抗药性研究作为当前杂草科学研究中最重要的课题之一。细胞突变体的筛选操作是在细胞水平上进行的,它可以不受时间、空间的限制,在较短的时间内处理大量的群体,获得具有期望性状的个体。本试验以模式植物烟草（NC-82）为诱导材料,利用细胞工程方法,以除草剂苯磺隆为选择药剂,筛选出抗苯磺隆的烟草愈伤组织并再生植株,以再生植株为研究对象,测定了苯磺隆对再生植株种子活力、根系活力以及叶绿素含量的影响,同时还对苯磺隆的作用靶标酶乙酰乳酸合成酶（ALS）和植物重要代谢酶谷胱甘肽-s-转移酶（GSTs）及各种保护酶进行了测定,为系统揭示杂草抗药性产生机理提供理论依据。研究结果如下:1.将烟草（NC-82）叶片诱导产生的胚性愈伤组织转移到加有半致死浓度3 a.i.mg.L-1苯磺隆的MS培养基上,经3代筛选,获得抗苯磺隆愈伤组织。在加有半致死浓度的苯磺隆分化培养基上,抗性愈伤组织通过分化再生植株。2.采用培养皿生测法测定再生烟草种子对苯磺隆的抗性。测定结果表明:经苯磺隆抗性选育的再生烟草抗性显著提高,抗性倍数为3.18。3.经苯磺隆处理后,抗性烟草和敏感烟草的叶绿素含量变化规律一致,均呈现先下降再上升,然后再下降的趋势,但抗性烟草叶绿素含量明显高于同期的敏感烟草,两者均在处理后第9d与各自对照差幅最大,叶绿素含量分别下降75.2%和82.3%。药剂处理9d后,抗性烟草叶绿素含量开始回升,而敏感烟草叶绿素含量则继续下降。处理后抗性烟草的根系活力较其对照下降不明显,且能在在较短时间内恢复;但敏感烟草的根系活力较其对照受到明显抑制。4.叶面喷施苯磺隆后,对不同天数烟草ALS活力进行测定,结果表明:敏感烟草的ALS活力较对照明显下降,ALS活力被抑制最高可达34.6%。而抗性烟草在叶面喷施苯磺隆后,ALS活性较对照显著提高,施药后第5天其ALS活力达到峰值,为对照的2.88倍,此后其ALS活力虽有所下降,但均远高于其同时间的对照水平。5.苯磺隆茎叶处理后,抗性及敏感烟草GSTs活性较各自对照均略微下降,而后逐渐上升,并于第5d达到峰值,分别是各自为对照的1.142和1.053倍。这表明两种烟草的GSTs在受到苯磺隆诱导后活性升高,解毒能力增强,快速代谢体内的苯磺隆。6.经苯磺隆茎叶处理后,两种烟草的POD活性较各自对照均有所提高,且二者活性随时间变化规律相似,均呈先上升后下降而后再略微上升的趋势,二者均在施药后第3d达到峰值,增幅分别为10.5%和7.6%。经苯磺隆茎叶处理后的SOD活性变化差异较大。敏感烟草SOD活性较其对照显著下降,药后第9d下降幅度最大,降幅为31.1%;而抗性烟草的SOD活性药后3d较对照有所降低,但后期SOD活性开始上升,在第5d时达到峰值,比同期对照高43.1%;随后其SOD活性逐渐下降,基本恢复到同期对照水平。叶面喷施苯磺隆后,两种烟草叶片MDA含量均呈现先略微下降而后急剧升高的趋势,但MDA含量增加幅度差异较大。施药后前5d,抗性及敏感烟草MDA含量较各自对照MDA含量均有所下降,最大降幅分别为18.6%和12.6%。5d后两种处理烟草的MDA含量都迅速升高,第9d,增幅达到最大,分别为29.1%和45.2%。7.采用室内生测法测定:苯磺隆抗性再生烟种与敏感烟种的简化活力指数分别为10.81和9.53;过氧化物酶活力分别为47.36U·g-1·min-1和29.44 U·g-1·min-1,酸性磷酸酯酶活力分别为2.927nmol·g-1·min-1和2.447nmol·g-1·min-1。两者间不存在显著性差异。再生抗性烟草的主要农艺性状如:株高、叶数、叶长、叶宽、产量等较对照也不存在显著性差异。8.培养皿生测法测定,再生苯磺隆抗性烟种对嘧硫草醚的抗性倍数为8.5倍,具有高水平的交互抗性;对噻吩磺隆、烟嘧磺隆的抗性倍数分别为2.016和1.927倍,具有较低等水平的交互抗性。而对莠去津的抗性倍数只有1.175,基本不存在明显的交互抗性。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 磺酰脲类除草剂概况
• 1.1.1 磺酰脲类除草剂创作过程
• 1.1.2 磺酰脲类除草剂的作用机制
• 1.2 植物对磺酰脲类除草剂的耐性机制
• 1.2.1 植物对磺酰脲类除草剂的吸收与传导
• 1.2.2 植物对磺酰脲类除草剂的代谢
• 1.2.3 磺酰脲类除草剂作用靶酶乙酰乳酸合成酶（ALS）的变异
• 1.3 植物组织培养的研究和应用
• 1.3.1 植物组织培养的概念
• 1.3.2 植物组织培养的应用
• 1.3.3 利用植物组织培养进行植物细胞突变体筛选的研究
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料、试剂及主要仪器
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 供试药剂及主要化学、生化试剂
• 2.1.3 试验用主要仪器
• 2.2 烟草愈伤组织抗性诱导与抗性植株再生
• 2.2.1 烟草愈伤组织的诱导和培养
• 2.2.2 培养基苯磺隆选择浓度的确定
• 2.2.3 抗苯磺隆愈伤组织的筛选及植株再生
• 2.3 两种不同烟草对苯磺隆的抗药性差异
• 2.3.1 供试材料的获得
• 2.3.2 烟草抗药性种子生物测定法
• 2.4 烟草对苯磺隆抗药性生理生化机制研究
• 2.4.1 烟草培育及苯磺隆药剂处理
• 2.4.2 苯磺隆对抗性烟草生物性状的影响
• 2.4.2.1 叶绿素含量测定
• 2.4.2.2 根系活力测定
• 2.4.3 乙酰乳酸合成酶活性测定
• 2.4.3.1 溶液配制
• 2.4.3.2 乙酰乳酸合成酶提取方法
• 2.4.3.3 乙酰乳酸合成酶活性测定方法
• 2.4.3.4 可溶性蛋白含量测定
• 2.4.4 苯磺隆对烟草 GSTs 活性的影响
• 2.4.4.1 谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的提取
• 2.4.4.2 谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的活性测定
• 2.4.4.3 可溶性蛋白含量测定
• 2.4.5 苯磺隆茎叶处理对烟草保护酶活性影响
• 2.4.5.1 过氧化物酶（POD）活性测定
• 2.4.5.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 2.4.5.3 丙二醛（MDA）含量测定
• 2.5 再生抗性烟草种子活力测定
• 2.5.1 种子萌发试验
• 2.5.2 种子电导率测定
• 2.5.3 种子酶活性测定
• 2.5.3.1 种子过氧化物酶（POD）活性测定
• 2.5.3.2 种子酸性磷酸酯酶的活性
• 2.6 生物性状测定
• 2.7 交互抗性的测定方法
• 3 结果与分析
• 3.1 培养基苯磺隆浓度对烟草愈伤组织成活率及选择浓度的确定
• 3.2 苯磺隆抗性再生烟草种子抗性潜势检测
• 3.3 烟草对苯磺隆抗药性差异的生理生化机制
• 3.3.1 苯磺隆对烟草生物性状的影响
• 3.3.1.1 苯磺隆对两种烟草叶绿素含量影响差异
• 3.3.1.2 根系活力的测定与计算
• 3.3.2 活体条件下苯磺隆对烟草 ALS 活力的影响
• 3.3.3 苯磺隆对烟草 GSTs 活性的影响
• 3.3.4 苯磺隆对烟草相关保护酶活性的影响
• 3.3.4.1 苯磺隆茎叶处理后烟草 POD 活性的变化
• 3.3.4.2 苯磺隆茎叶处理后烟草SOD 活性的变化
• 3.3.4.3 苯磺隆茎叶处理后烟草MDA 活性的变化
• 3.3.5 再生抗性烟草种子活力测定
• 3.3.5.1 再生烟草种子萌发测定
• 3.3.5.2 再生抗性种子电导率及几种酶活力测定
• 3.3.6 农艺性状的遗传力分析
• 3.3.7 烟草对几种除草剂的交互抗性
• 4 讨论
• 4.1 关于烟草愈伤组织对苯磺隆的抗性诱导及抗性植株的筛选
• 4.2 两种不同烟草对苯磺隆的抗药性差异
• 4.3 关于再生烟草对苯磺隆的抗性机制
• 4.4 关于再生抗性烟草种子活力和农艺性状的研究
• 4.5 关于苯磺隆抗性烟草的交互抗性
• 4.6 本论文的不足及有待进一步研究之处
• 4.6.1 关于抗性研究的试验材料
• 4.6.2 关于植物其他酶系对苯磺隆的代谢
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文