马铃薯青枯病抗性相关基因的分离及其功能分析

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L．）是继小麦、玉米、水稻之后的世界第四大作物，在世界的食品安全体系中具有重要的作用。由青枯病菌Ralstonia solanacearum引起的马铃薯青枯病是仅次于马铃薯晚疫病的世界性病害，目前尚没有行之有效的化学药剂防治办法，严重影响了马铃薯的生产。培育抗病品种已成为防治马铃薯青枯病的根本手段。长期以来人们对马铃薯青枯病的研究和探讨主要集中在病菌的病理学机制、分类学、流行病学等方面，而在马铃薯本身的抗病遗传特性、马铃薯青枯病抗性相关基因的种类、数量及其表达调控途径等方面还不清楚。本研究旨在通过马铃薯青枯病抗性相关基因的分离和分析，初步揭示参与青枯病抗性的基因种类与数量，为进一步深入开展青枯病的抗病机制研究及利用抗性资源进行抗病品种选育奠定基础。主要研究结果如下：1．建立了快速可靠的马铃薯抗青枯病鉴定新方法，并筛选出了13份抗或高抗青枯病和高感青枯病的二倍体材料。采用传统方法和改进方法对马铃薯二倍体CE和ED群体、番茄抗病和感病品系进行了青枯病抗性鉴定和评价，建立了更加简便快速、经济和可重复的病菌鉴定新方法—茎枝菌液共培养法，该方法对于茄科作物的种质资源抗病性评价和筛选，特别是对于病菌诱导产生抗性的抗（感）病植株的快速鉴定及其幼苗的先期快速筛选具有重要意义。同时利用该方法筛选出了6份抗或高抗青枯病材料和7份高感青枯病材料（见表2.4），其中6个材料（如高抗青枯病基因型ED13、高感青枯病基因型ED25等）已被用于亲本构建作图群体，为今后开展马铃薯的抗病遗传研究奠定了基础。2．建立了富集差异表达基因的SSH文库并获得了44个病菌侵染早期马铃薯抗青枯病相关基因。以抗青枯病二倍体基因型ED13为材料，青枯病菌小种3号PO41为供试菌株，利用抑制差减杂交（SSH）和微阵列杂交筛选技术相结合，获得了123个差异表达的非重复的早期抗病相关基因EST片段，其中99个（80％）EST可找到与其具有较高同源性的序列(0＜E-值＜10-10)，16个（13％）可找到较低同源性的序列(E-值＞10-10)，8个（7％）无同源序列。这些无同源序列或具有较低同源性的序列可能代表新基因。在123个差异表达的EST中，除22％的功能未知或已知功能而未分类和8％的无同源序列外，其余70％的EST分属于初级代谢、能量代谢、细胞结构、调控、蛋白合成／修饰／加工、转运相关、抗病防御、转录相关和信号转导等生命过程。在获得的123个差异表达EST中，至少有44个（约35.8％）参与了马铃薯的抗青枯病反应。这些EST对应的基因涉及到信号识别、信号转导、转录调控、过敏（HR）反应、系统获得性抗性（SAR）、细胞自救与抗病防御等抗病反应的基本过程。这些抗病相关基因中大部分与已知基因高度同源，预示着这些基因较为保守，在不同植物种的抗病反应中可能具有重要的作用。3．构建了一个富集青枯病抗性相关基因的SMART cDNA文库。以青枯病菌小种3号（PO41）诱导24h和48 h的马铃薯高抗青枯病二倍体基因型ED13的叶片为材料，利用SMART和LD-PCR技术相结合构建了一个富集青枯病抗性相关基因的全长cDNA文库，为进行重要基因全长cDNA的克隆奠定了基础。所建文库的原始文库和扩增文库滴度分别为4.4×106和1.8×1010pfu／ml，重组率为96％，插入片段大小分布在400-1800 bp，平均大小为700-1000 bp。4．获得了三个基因的全长cDNA、四个基因的RACE产物及它们的诱导表达模式。利用RACE与LD-PCR方法和cDNA文库相结合，快速获得了三个具有完整开放阅读框架基因的全长cDNA（StPI、StPMEI和StDnaJ）和四个抗病相关基因（L51、L77、L181和L362）cDNA的5’和3’RACE的PCR产物，同时研究了这些基因的诱导表达。具体为：StPI编码116个氨基酸，与马铃薯蛋白酶抑制子Ⅰ前体cDNA有较高的同源性（核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为89％和74％）。该基因受青枯病菌的诱导和JA的调节，均为上调。推测StPI基因是马铃薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成员，在马铃薯的抗青枯病的反应中可能具有重要作用。该基因已在GenBank注册，序列号为DQ822994。StPMEI编码198个氨基酸，与烟草果胶甲脂酶抑制子基因具有较高的同源性（核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为85％和78％）。StPMEI基因的表达受青枯病菌侵染的抑制，可能与病菌侵染早期促使果胶甲脂酶（PME）表现活性，加固细胞壁有关；但该基因又受JA的诱导可能与病菌侵染后期细胞壁的扩展和新细胞壁的建立有关。该基因已在GenBank注册，序列号为DQ822993。StDnaJ编码177个氨基酸，与拟南芥DnaJ-like基因的部分核苷酸具有84％的一致性，与其编码的氨基酸序列具有59％的一致性。该基因受青枯病菌的诱导，也受JA的调节。但JA诱导后其上调表达明显比青枯病菌诱导提前，且其维持高表达水平的时间也明显缩短。该基因已在GenBank注册，序列号为DQ885360。L51（methyl-CpG-binding domain-containing protein）和L77（putatively encoding receptor-like kinase RHG1）均受青枯病菌的诱导，但它们的受诱导速度不同。L51在6-12小时内表达量即达到最高；L77约需48小时才可达到最高表达量。这两个基因均不受JA的调节。L181（phosphatase 2C）同时存在于抗病基因型和感病基因型中，在抗病基因型ED13中受青枯病菌的诱导下调表达，与此相反却受JA的诱导上调表达；在感病基因型ED25中，该基因不受JA调节。预示着对于L181而言，病菌处理和JA刺激可能采用不同的调节途径，并且该基因在抗病材料中因受诱导下调表达而参与抗病反应。L362（protein kinase Pti1）同时受青枯病菌的诱导和JA的调节，其表达模式与StDnaJ相似，均为上调表达。在处理24小时之前该基因的mRNA积累量即达到最高，并且L362在JA诱导后其上调表达明显比青枯病菌的诱导提前。Pti1基因为Pro基因的下游基因，参与番茄的抗病反应，推测L362也可能参与了马铃薯的抗青枯病反应。总之本研究不仅为我们提供了一些有益的数据（ESTs），还有助于提高我们对马铃薯与青枯病菌互作本质的认识，并且有些EST将可能被转化为分子标记进行马铃薯抗青枯病的标记辅助育种。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 青枯病研究进展
• 1.2.1 青枯病菌的研究概况
• 1.2.2 植物抗病机制及病原与植物的互作
• 1.2.3 抗青枯病研究进展
• 1.2.4 问题与探讨
• 1.3 植物抗病基因的克隆方法
• 1.3.1 图位克隆
• 1.3.2 转座子标签法
• 1.3.3 抗病基因类似物法
• 1.3.4 转录水平上几种常用方法的比较
• 1.4 抑制差减杂交
• 1.4.1 抑制差减杂交技术的基本原理
• 1.4.2 抑制差减杂交技术的发展
• 1.4.3 SSH方法在植物基因分离上的应用
• 1.4.4 小结
• 1.5 本研究的目的和预期目标
• 1.6 总体设计
• 第二章 几种马铃薯抗青枯病鉴定方法的比较
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试青枯病菌株及材料
• 2.2.2 青枯病菌的培养
• 2.2.3 青枯病菌接种
• 2.2.4 抗病性评价方法和标准
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 茎枝菌液共培养法与灌根法和毛细管菌液滴注法鉴定马铃薯的比较
• 2.3.2 茎枝菌液共培养法与灌根法及毛细管菌液滴注法鉴定番茄的比较
• 2.4 讨论
• 第三章 青枯病菌胁迫下的马铃薯早期基因表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料与处理
• 3.2.2 总 RNA的提取及mRNA的分离
• 3.2.3 SSH文库的构建
• 3.2.4 测序及序列分析
• 3.2.5 差减文库筛选
• 3.2.6 Northern印迹
• 3.2.7 半定量 RT-PCR验证
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 试验材料的选择及取材时间的确定
• 3.3.2 总 RNA的提取及mRNA的分离
• 3.3.3 cDNA的合成及合成效率检测
• 3.3.4 接头连接效率及差减杂交效率检测
• 3.3.5 差减产物克隆及文库质量评价
• 3.3.6 测序和差异表达片段的筛选
• 3.3.7 差异表达片段的Northern和 RT-PCR验证
• 3.3.8 基因的功能分析
• 3.3.9 抗病相关基因
• 3.4 讨论
• 3.4.1 基于 SSH方法所得结果的可靠性
• 3.4.2 SSH是获得新基因和低丰度表达基因的有效方法
• 3.4.3 信号识别相关 EST
• 3.4.4 信号转导和转录因子
• 3.4.5 过敏反应与系统获得性抗性
• 3.4.6 马铃薯与青枯病菌互作中的抗病防御
• 第四章 马铃薯青枯病抗性相关基因cDNA的分离及表达分析
• 第一节 马铃薯青枯病抗性相关基因（全长）cDNA的获得
• 4.1.1 引言
• 4.1.2 材料与方法
• 4.1.2.1 试验材料与处理
• 4.1.2.2 总 RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 4.1.2.3 RACE
• 4.1.2.4 PCR产物的克隆与测序
• 4.1.3 结果与分析
• 4.1.3.1 总 RNA的提取
• 4.1.3.2 RACE-PCR产物分析
• 4.1.3.3 序列分析
• 4.1.4 讨论
• 第二节 马铃薯青枯病抗性相关基因的诱导表达
• 4.2.1 引言
• 4.2.2 材料与方法
• 4.2.2.1 试验材料与处理
• 4.2.2.2 总 RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 4.2.2.3 青枯病菌和 JA诱导表达
• 4.2.3 结果与分析
• 4.2.3.1 两个具有全长cDNA基因的青枯病菌及 JA诱导表达
• 4.2.3.2 尚未获得全长cDNA基因的JA诱导表达
• 4.2.4 讨论
• 4.2.4.1 蛋白酶抑制子在植物的抗病反应中具有重要作用
• 4.2.4.2 PMEI与 PME协同作用调节细胞壁的稳定性和参与细胞壁的重建
• 4.2.4.3 植物类受体激酶参与抗病防御
• 4.2.4.4 磷酸酯酶 2C对 JA的响应
• 4.2.4.5 蛋白激酶 Pti1类似物可能功能
• 第五章 cDNA文库结合 RACE方法克隆马铃薯 DnaJ-like基因全长cDNA
• 第一节 富集青枯病抗性相关基因 SMART-cDNA文库的构建
• 5.1.1 引言
• 5.1.2 材料与方法
• 5.1.2.1 试验材料与处理
• 5.1.2.2 双链cDNA合成
• 5.1.2.3 双链cDNA的酶切与连接
• 5.1.2.4 噬菌体的体外包装
• 5.1.2.5 效价测定与文库扩增
• 5.1.3 结果与分析
• 5.1.3.1 总RNA抽提
• 5.1.3.2 双链cDNA合成及分级分离
• 5.1.3.4 文库质量检测
• 5.1.4 讨论
• 第二节 马铃薯DnaJ-like基因全长cDNA的克隆
• 5.2.1 引言
• 5.2.2 材料与方法
• 5.2.2.1 试验材料与处理
• 5.2.2.2 目的基因5’端序列的扩增
• 5.2.2.3 茉莉酸诱导表达
• 5.2.3 结果与分析
• 5.2.3.1 马铃薯DnaJ-like基因的分离
• 5.2.3.2 序列分析
• 5.2.3.3 马铃薯DnaJ-like基因的诱导表达
• 5.1.4 讨论
• 第六章 结论
• 后续工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 研究生期间发表和待发表的主要论文