聚乙二醇化尿酸酶的制备、纯化及性质研究

论文摘要

尿酸酶分解嘌呤代谢最终产物尿酸，生成水溶性更强，更易分解的尿囊素。当尿酸在血液中沉积，引起肾衰竭以及痛风等疾病。尿酸酶针对禁忌常规治疗和常规疗法无效的患者，能快速降低血液中尿酸盐的含量。但作为外源蛋白有较高抗原性，影响了尿酸酶的活性。需要在尿酸酶分子表面结合一种水溶性高聚物，从而降低尿酸酶的抗原性，延长它在体内的半衰期。蛋白质PEG修饰技术在过去的20年中得到了快速发展，已有多篇文献报道了经PEG修饰的蛋白质药物降低了免疫原性、提高了稳定性、延长了半衰期，并用于临床治疗各种疾病。本文研究尿酸酶聚乙二醇修饰的条件、纯化方法以及修饰产物生物学活性和酶动力学性质的改变。通过对温度、pH、尿酸酶浓度、PEG和尿酸酶质量比等条件的筛选，确定pH8.5，4℃，尿酸酶与PEG2-NHS质量比1：10，尿酸酶浓度2mg／mL为最佳修饰条件，10min内反应完全。凝胶过滤层析测定尿酸酶分子量为70kD，结合还原和非还原性SDS-PAGE判断尿酸酶由两条分子量30kD的亚基通过二硫键组合而成。制备型PAGE电泳分离纯化后，尿酸酶和PEG-尿酸酶通过SDS-PAGE电泳检测均为单一条带。收集凝胶，回收反应混合液总活性的46.7％，目标产物130kD的PEG-尿酸酶占12％。尿酸酶最适温度和pH分别为40℃、pH8.5，经PEG修饰后，最适温度和pH变为35℃、pH8.0。修饰前后的尿酸酶在pH7.5-9.0范围内，温度40℃以下都比较稳定，PEG-尿酸酶在各个pH范围内都比尿酸酶相对稳定，修饰后尿酸酶的热稳定性也有所提高。在最适条件下，测定尿酸酶和PEG-尿酸酶Km分别为16.62×10-5mol／L、17.8×10-5mol／L。测定了尿酸酶和PEG-尿酸酶Km随pH、温度改变的变化情况，Km均高于最适条件得出的结果。采用TNBS法测定尿酸酶的氨基修饰率为16.7％。修饰后的PEG-尿酸酶抗胰蛋白酶水解能力明显高于未修饰的尿酸酶，在胰蛋白酶作用40min后仍保留原活性的20％，而尿酸酶在胰蛋白酶作用30min后活性就完全丧失。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 综述
• 1 蛋白质的化学修饰
• 1.1 原理和意义
• 1.2 蛋白质化学修饰方法
• 1.2.1 蛋白质的性质
• 1.2.2 修饰剂的选择
• 1.2.3 反应条件的选择
• 1.3 化学修饰对蛋白质性质的影响
• 1.3.1 保护活性部位和抗抑制剂
• 1.3.2 增强稳定性和耐热性
• 1.3.3 维持完整性与抗蛋白水解酶
• 1.3.4 消除抗原性和稳定微环境
• 1.4 蛋白质化学修饰的展望
• 2 聚乙二醇偶联
• 2.1 PEG修饰的原理与方法
• 2.1.1 氨基的修饰
• 2.1.2 半胱氨酸（巯基）的修饰
• 2.1.3 氧化的糖或N端的修饰
• 2.2 修饰过程
• 2.2.1 液相反应
• 2.2.2 固相反应
• 2.3 反应产物的鉴定和检测
• 2.3.1 蛋白质或多肽的平均修饰度
• 2.3.2 修饰位点和位置异构体的检测
• 2.3.3 偶合物的均一性
• 2.4 PEG修饰蛋白药物的开发与临床应用状况
• 3 尿酸酶介绍
• 3.1 尿酸酶概述
• 3.2 尿酸酶的反应机制
• 3.3 尿酸酶与嘌呤代谢
• 3.4 灵长动物中尿酸酶分子进化
• 3.5 尿酸酶在临床检测和治疗上的应用
• 3.5.1 尿酸酶在临床检测上的应用
• 3.5.2 尿酸酶在临床治疗上的应用
• 第二部分 实验
• 第一章 PEG修饰尿酸酶反应的条件优化
• 1.1 试剂和仪器
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 蛋白浓度测定
• 1.2.2 SDS-PAGE
• 1.2.3 PAGE电泳
• 1.2.4 分子筛电泳
• 1.2.5 尿酸酶分子量和结构分析
• 1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶的碘染色
• 1.2.7 尿酸酶PEG修饰反应进程分析
• 1.2.8 尿酸酶浓度对修饰反应的影响
• 1.2.9 尿酸酶和PEG质量比对修饰反应的影响
• 1.2.10 温度对修饰反应的影响
• 1.2.11 pH对修饰反应的影响
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 尿酸酶分子量和结构分析
• 1.3.2 尿酸酶PEG修饰反应进程分析
• 1.3.3 尿酸酶浓度对修饰反应的影响
• 1.3.4 尿酸酶和PEG质量比对修饰反应的影响
• 1.3.5 温度对修饰反应的影响
• 1.3.6 pH对修饰反应的影响
• 1.4 本章小结
• 第二章 PEG化尿酸酶的分离纯化
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 尿酸酶活性测定方案
• 2.2.2 蛋白含量的测定
• 2.2.3 制备电泳分离纯化PEG-尿酸酶
• 2.2.4 凝胶过滤层析测定尿酸酶及PEG-尿酸酶分子量
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 制备电泳
• 2.3.2 Sephacryl S200凝胶过滤层析测定尿酸酶分子量
• 2.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析
• 2.4 本章小结
• 第三章 PEG化尿酸酶的性质研究
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶活力的测定方案
• 3.2.2 pH对尿酸酶活性影响的研究
• 3.2.3 温度对尿酸酶活性影响的研究
• m）的测定'>3.2.4 米氏常数（K_m）的测定
• 3.2.5 TNBS法测定尿酸酶修饰度
• 3.2.6 抗胰蛋白酶水解能力分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 pH对尿酸酶及PEG化尿酸酶活性的影响
• 3.3.2 温度对尿酸酶及PEG化尿酸酶活性影响
• m）的测定'>3.3.3 米氏常数（K_m）的测定
• 3.3.4 TNBS法测定尿酸酶氨基修饰度
• 3.3.5 抗胰蛋白酶水解能力分析
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间所发表文章目录