论文摘要
自1980年世界上第一只转基因小鼠制备成功后,科学家们就开始进行转基因鸡的研究,因为转基因鸡无论在基础理论研究方面还是在生物技术领域都具有独特的优势,因此建立行之有效的转基因鸡制备技术一直是一个研究的热点领域。虽然世界上已有成功获得转基因鸡的先例,但国内还没有成功获得转基因鸡的报道。本研究拟以绿色荧光蛋白基因为报告基因应用慢病毒载体感染法开展转基因鸡制备研究,希望外源基因能够整合到性腺中,并能够稳定的传递给下一代,以在国内率先建立起一个行之有效的转基因鸡制备技术体系。种蛋的质量是成功获得转基因鸡不可忽视是的一个重要因素。为获得优质的种蛋,以保证实验的顺利进行,我们对周围几个鸡场的种蛋进行筛选。通过实验证实,大午集团的种蛋优于其它鸡场的种蛋。对鸡胚操作后再进行培养的方法有两种,为开窗术和代用蛋壳法。在本研究中采用开窗术进行鸡胚的培养。在对刚产出的种蛋进行消毒处理后,室温条件下水平放置过夜,使胚胎漂浮到最上端。用70%酒精擦拭后,用电磨在赤道面上锯一5mm×5mm见方的口后就可以看到胚胎,然后向其中加一定量的稀蛋清,最后用石蜡和封口膜封口。采用变温孵化。孵化结果显示石蜡封口的孵化率高于封口膜封口。为研究显微注射所造成的机械损伤对孵化率的影响。我们开展了向鸡胚胚下腔注射DMEM液体培养基实验。对新鲜种蛋消毒和开口处理后,利用显微注射的方法向胚下腔中注射2～2.5uLDMEM液体培养基。共成功注射25枚种蛋,最后有9只雏鸡出壳,其孵化率为36%。结果显示我们的注射方法满足后续实验的进行。本研究中制备转基因鸡的方法为慢病毒载体法。慢病毒载体法是制备转基因鸡方法中最为成熟的一种方法。所使用的慢病毒载体为三质粒系统,即由穿梭质粒,包装质粒和包膜质粒构成。在穿梭质粒中用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因。采用逐级稀释法和感染293FT细胞实验进行病毒滴度的测定。其结果显示病毒滴度为1×10~9感染单位/mL(TU/mL)。在进行转基因鸡制备实验中,我们向鸡胚胚下腔内注射2～2.5uL携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体悬液,其滴度为1×10~9U/mL,对其封口后进行孵化。共成功注射110枚种蛋,最后得到了32只原代鸡。在鸡30日龄时,我们从鸡翅静脉采血,利用酚氯仿抽提方法提取鸡血基因组DNA,通过基因组DNA PCR方法扩增EGFP和部分载体序列。其中有4只扩增出同预期大小一致目的片段。更为有意义的是,在所养的16只公鸡性成熟后,采其精液再利用酚氯仿抽提方法提取精液的基因组DNA,通过PCR扩增和对目的片段回收测序方法鉴定,其结果显示有6只公鸡发生了性腺整合,其性腺整合率达到37.5%.总之,本研究建立了利用开窗术培养鸡胚和慢病毒载体制备转基因的方法,为后续开展转基因鸡研究创造了有利条件。