论文摘要
第一章:HIF-1α和VEGF小干扰RNA对人血管内皮细胞HIF-1αl和VEGF表达的抑制目的:探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞HIF-1α和VEGF表达的影响。方法:构建HIF-1αsiRNA重组质粒。将体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中,采用脂质体LipofectamineTM2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1αsiRNA（HIF-1α组）、VEGF165siRNA（VEGF组）和HIF-1αsiRNA+VEGF165siRNA（共转染组）,低氧组中未转染的细胞为低氧对照组。常氧组细胞不做转染。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后重组质粒的表达;RT-PCR和免疫细胞化学法检测细胞中HIF-1α和VEGF基因和蛋白表达的变化。结果:成功构建HIF-1αsiRNA重组质粒。人脐静脉血管内皮细胞转染24h后,HIF-1αsiRNA和VEGF165siRNA重组质粒有表达。细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达水平:常氧组细胞HIF-1αmRNA有表达,但未见明显HIF-1α蛋白表达,低氧对照组和空载体组细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达较常氧组增强,而HIF-1α组较低氧对照组明显减弱（P＜0.01）,mRNA抑制效率为59.8%。细胞VEGF mRNA及蛋白表达水平:常氧组细胞仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达,而缺氧后表达明显上调（P＜0.01）;HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较低氧对照组减弱（P＜0.01）,mRNA抑制效率分别为39.7%、68.1%和82.3%,其中共转染组抑制效果最明显。结论:HIF-1α和VEGF165siRNA能有效抑制人脐静脉血管内皮细胞HIF-1α和VEGF的表达。第二章:HIF-1a和VEGF小干扰RNA对鼠视网膜新生血管的抑制目的:探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法:C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射pEGFP-N1-脂质体复合物,1d后视网膜铺片观察GFP的表达。选7d龄C57BL/6J小鼠117只,其中21只为正常组;另96只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,并随机分为:模型对照组、空载体组和基因治疗组（HIF-1α组、VEGF组和共转染组）。于出舱前1d,采用脂质体介导的转染方法,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α组注射HIF-1αsiRNA;VEGF组注射VEGF165siRNA;共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165siRNA。RT-PCR检测转染后重组质粒的表达;采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;组织切片观察并计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;RT-PCR、免疫组化和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达。结果:RT-PCR检测发现小鼠视网膜中HIF-1αsiRNA和VEGF165siRNA重组质粒有表达;pEGFP-N1经脂质体介导转染视网膜后1d即可见GFP表达;视网膜铺片可见基因治疗组较模型对照组和空载体组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,共转染组效果最明显;组织切片可见基因治疗组较其他三组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均有统计学意义（P＜0.01）;视网膜HIF-1αmRNA及蛋白表达水平:模型对照组和空载体组较正常组上调,而HIF-1α组较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异有统计学意义（P＜0.01）。VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组和空载体组较正常组明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义（P＜0.01）,共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%。结论:HIF-1α和VEGF165siRNA均能有效抑制小鼠视网膜新生血管的形成,两者共转染抑制效果更明显。
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标签：干扰论文; 人脐静脉血管内皮细胞论文; 视网膜新生血管论文; 缺氧诱导因子论文; 血管内皮生长因子论文;