热处理对乳铁蛋白理化特性及促成骨细胞增殖活性的影响

论文摘要

乳铁蛋白是人乳中重要的蛋白质，占人乳中总蛋白量的20%左右，但它并不是人乳的特有成分，其广泛的存在于哺乳动物的乳汁和体液中，是一种多功能性的碱性蛋白。随着乳铁蛋白独特功能性揭示，人们越来越关注在功能性食品中乳铁蛋白的添加，婴儿配方奶粉就是乳铁蛋白的主要添加对象。但在婴儿乳粉的生产中，天然牛乳需要经过多个热处理过程，因此牛乳铁蛋白的活性必将不同程度的受到影响，这点是被大多数人所忽略的。大量资料显示，乳铁蛋白对热极敏感，且易发生热聚集现象，本研究旨在加工过程中的必须热处理环节对牛乳铁蛋白理化性质，蛋白热聚集的影响做了初步探索，并考察其在热处理后对成骨细胞促增殖活性的影响，以便为乳粉的加工过程，特别是功能性乳粉的加工提供有效的温度控制工艺参数。本实验选取粗提纯的天然牛乳铁蛋白进行再次分离纯化，纯度达到90%，与Sigma公司乳铁蛋白标品相当。通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白分子量，用Quantity One软件进行蛋白条带的分析，得到纯度为90%的乳铁蛋白样品，其纯度与购于Sigma公司的90%纯度乳铁蛋白标品相当。随后，将纯化后的乳铁蛋白制备成铁饱和型乳铁蛋白（Holo-Lf）和完全缺铁型乳铁蛋白（Apo-Lf），冷冻干燥，备用。将三种不同铁饱和度的乳铁蛋白粉配制成相同浓度的蛋白溶液，确定三种蛋白各自的铁饱和度。制得样品的铁饱和度依次为：常态乳铁蛋白铁饱和度为15.32%，铁饱和型乳铁蛋白的铁饱和度为89.10%，缺铁型乳铁蛋白的铁饱和度为3.73%。运用示差扫描量热仪（DSC），测定三种不同铁饱和度乳铁蛋白的热诱变峰值，为热处理温度提供依据。通过示差扫描量热仪检测结果为，常态乳铁蛋白（Native-Lf）有两个热诱变峰值，分别为62.66℃和69.83℃，缺铁型乳铁蛋白（Apo-Lf）的热诱变峰值为62.10℃，而铁饱和型乳铁蛋白（Holo-Lf）的热诱变峰值为70.18℃，因此，选取加热条件为60℃、65℃、70℃、80℃、90℃，水浴5min。在此热处理后，通过酶标仪测定加热后三种不同结合态乳铁蛋白的铁饱和度情况，与未加热前的数值进行对比，考察热处理对乳铁蛋白铁饱和度的影响。实验结果显示，铁饱和型乳铁蛋白受热后铁饱和度基本无变化，80℃加热5min条件下，常态乳铁蛋白呈现失铁现象，缺铁型乳铁蛋白在80℃加热条件下铁饱和度降低也较为明显。通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳观察加热后三种乳铁蛋白的分子量变化情况，通过软件分析，确定热处理后蛋白质是否发生热聚集或热分解。同时，将热处理后的三种蛋白样品5000g离心处理10min，提取上清液，通过酶标仪测定吸光度，与标准曲线结合，确定热处理后蛋白浓度的变化。将此结果与电泳结果相结合考察蛋白质热聚集现象。研究发现，常态乳铁蛋白在加热温度为70℃时开始发生热聚集现象，并且蛋白含量开始降低。铁饱和型乳铁蛋白在加热温度为90℃时发生轻微热聚集现象。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为70℃时发生热聚集现象，且比常态乳铁蛋白现象明显，蛋白含量也最低。本实验成功分离及鉴定了新生Wistar大鼠头盖骨处的成骨细胞，并进行传代培养。将热处理后的三种不同铁饱和度的乳铁蛋白分别与成骨细胞作用48h，用四唑盐比色法（MTT）检测增殖情况后发现，常态乳铁蛋白加热到70℃时活性下降，铁饱和型乳铁蛋白加热温度为80℃时活性开始下降。缺铁型乳铁蛋白在加热温度为70℃时活性显著下降，但加热温度为90℃时，活性恢复.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 乳铁蛋白及其理化性质
• 1.3 乳铁蛋白热稳定性的研究
• 1.4 乳铁蛋白与铁结合状态的研究
• 1.4.1 铁饱和型乳铁蛋白的结构
• 1.4.2 缺铁型乳铁蛋白的结构
• 1.5 乳铁蛋白生物功能研究
• 1.5.1 乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性影响的研究
• 1.5.2 乳铁蛋白其他生物活性的研究
• 1.6 本课题研究的立题背景、研究意义和内容
• 1.6.1 立意背景及研究意义
• 1.6.2 研究内容
• 2 牛乳铁蛋白样品的制备及热稳定性的测定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验仪器及设备
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 乳铁蛋白纯化结果
• 2.3.2 三种不同结合态乳铁蛋白示差扫描量热仪图谱
• 2.3.3 结果分析
• 2.4 本章小结
• 3 热处理对牛乳铁蛋白样品铁饱和度的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 实验仪器及设备
• 3.2.4 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 样品加热前铁饱和度测试结果与分析
• 3.3.2 样品加热后铁饱和度测试结果与分析
• 3.4 本章小结
• 4 热处理对牛乳铁蛋白聚合物的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 实验仪器及设备
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 凝胶电泳结果
• 4.3.2 蛋白浓度的测定
• 4.4 本章小结
• 5 热处理对牛 LF 促成骨细胞增殖活性影响的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验试剂
• 5.2.3 实验仪器及设备
• 5.2.4 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 成骨细胞的分离培养
• 5.3.2 成骨细胞的鉴定
• 5.3.3 四唑盐比色法（MTT）检测促成骨细胞增殖活性
• 5.4 本章小结
• 6 总结及展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录