耐四环素类基因在鸭源大肠杆菌的传播扩散机制

论文摘要

目的:探索鸭源大肠杆菌对四环素类耐药的分子机制和四环素耐药基因（tet基因）的传播扩散机制。方法:根据CLSI2008推荐的方法,对临床分离48株鸭大肠杆菌针对四环素、土霉素、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻肟和阿米卡星共7种药物进行耐药表型检测;设计6对特异性引物分两组对48株分离菌进行tet基因的多重PCR检测,第Ⅰ组:tetB, tetC,tetD;第Ⅱ组: tetA, tetE,tetM,分析tet基因组合、分布特点;以代表性tet基因组合的分离菌做供体菌,以利福平耐药的大肠杆菌C600为受体菌,通过质粒接合试验观察tet基因和四环素类耐药性的质粒传递;分别采用定位PCR（PCR mapping）和基因克隆方法研究tetM和tetA的基因环境:设计四对特异性引物UM500、CM、DM500a和DM500b,分别PCR扩增tetM基因的上游序列、tetM基因ORF和tetM基因下游序列,试验菌株为含tetM基因的两株接合子和20株分离菌;采用基因克隆方法研究tetA的基因环境:试验菌株为两株含tetA基因的接合子,用pBluescriptⅡSK（+）作为载体质粒,将接合子质粒和载体质粒分别按以下四种方案进行酶切:○1 EcoR I和Xho I双酶切。○2 EcoR I和SalI双酶切。○3 EcoR I单酶切。○4 BamH I单酶切。然后用T4连接酶将二者酶切产物进行体外连接,克隆到感受态细胞DH5a中,用LB/AMP/DOX/X-gal/IPTG平板进行蓝白斑筛选,挑选白色菌落即为阳性重组质粒克隆株,酶切、电泳确认正确插入后,插入的目的片段用载体通用引物M13测序。用ERIC-PCR对20株分离菌进行基因分型,分析其克隆关系。结果:48株分离菌全部对土霉素和四环素耐药,耐药率100%,36株对多西环素耐药,耐药率75%;对氟苯尼考、恩诺沙星和头孢噻肟的耐药率分别为79.17%、60.4%和27.08%,对阿米卡星比较敏感,大部分鸭大肠杆菌呈现多重耐药特性。分离菌tet基因均有阳性检出,检测到的4个tet基因有3种组合类型,其中tetA+B+C 21株,tetA+B+C+M 26株,tetA+C 1株;4种tet基因均能通过质粒接合转移到受体菌,使7株接合子中的5株、5株和4株分别获得对土霉素、四环素和多西环素的耐药性,3株供体菌的4个tet基因不能同时通过质粒接合传递给受体菌。经测序分析,共得到tetM及其上游序列2632bp,上游序列为转座子Tn916,两株接合子及相应的供体菌结果相同,6株分离菌Tn916阳性,占试验菌株的30%;tetA及其上下游序列约11.9kb,上游为一些分子伴侣、dnaJ、stbE和stbD,末端为Xho I酶切位点,tetA与tetR一起位于Tn1721中,下游为tnpA、Tn21、整合子IntI和dfrA12,末端为EcoR I酶切位点,两株接合子的试验结果相同。用ERIC-PCR对20株分离菌进行基因分型,共出现六种基因型,分别描述为A、B、C、D、E和F型;细菌基因型与耐药模式和携带四环素耐药基因型之间没有明显联系。结论:鸭源大肠杆菌对四环素类的耐药有四环素外排作用、核糖体保护两种特异性机制。tet基因以三种组合（tetA+B+C）和四种组合（tetA+B+C+M）为主。4个tet基因可以同时或不同时通过质粒接合在细菌间转移,使部分受体菌获得对四环素类的耐药性。四环素耐药基因tetM和tetA可以分别由转座子Tn916和Tn1721及Tn21和整合子IntI一起在鸭大肠杆菌之间进行质粒-质粒传递。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 四环素类药物的性质及其作用机理
• 1.2 细菌对四环素类药物耐药性现状
• 1.3 细菌对四环素类药物的耐药机理
• 1.4 tet 基因的分布和转移
• 2 引言
• 3
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 药品
• 3.1.3 试剂
• 3.1.3.1 培养基
• 3.1.3.2 分子生物学试剂
• 3.1.3.3 载体
• 3.1.4 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株鉴定
• 3.2.2 液、固体培养基及平板的制备和细菌菌液及试剂的制备
• 3.2.2.1 药液的制备
• 3.2.2.2 培养基及平板的制备
• 3.2.2.3 细菌菌液的制备
• 3.2.2.4 试剂的配制
• 3.2.3 菌株的敏感性定
• 3.2.4 四环素类耐药基因的多重PCR检测
• 3.2.4.1 耐药基因的引物设计
• 3.2.4.2 模板DNA的提取
• 3.2.4.3 引物分组及反应条件优化
• 3.2.4.4 核苷酸序列测序及分析
• 3.2.5 四环素耐药基因的质粒接合传递
• 3.2.5.1 供体菌与受体菌大肠杆菌C600的接合
• 3.2.5.2 阳性接合子的筛选及验证
• 3.2.5.2.1 供体菌、接合子的敏感性检测
• 3.2.5.2.2 供体菌与接合子的质粒提取
• 3.2.5.2.3 供体菌、接合子的tet基因型检测
• 3.2.6 tetM和tetA的基因环境
• 3.2.6.1 tetM的基因环境
• 3.2.6.1.1 tetM的上游环境和下游环境引物设计
• 3.2.6.1.2 细菌基因组模板的制备
• 3.2.6.1.3 上游序列及下游序列的PCR扩增
• 3.2.6.1.4 测序及分析
• 3.2.6.2 tetA的基因环境
• 3.2.6.2.1 pBluescriptⅡSK（+）-tetA重组质粒的构建
• 3.2.6.2.1.1 pBluescriptⅡSK（+）及结合子双酶切
• 3.2.6.2.1.2 连接反应及阳性重组子的筛选
• 3.2.6.2.2 pBluescriptⅡSK（+）-tetA重组质粒的测序及分析
• 3.2.7 Eric PCR
• 3.2.7.1 模板DNA的制备
• 3.2.7.2 Eric PCR 的扩增
• 3.2.7.3 同源性判定标准
• 4 结果与分析
• 4.1 分离菌株的敏感性检测结果
• 4.2 四环素类耐药基因的多重PCR检测
• 4.2.1 多重PCR检测结果
• 4.2.2 核苷酸序列测序及同源性比较结果
• 4.3 质粒接合实验结果
• 4.3.1 供体菌与接合子的基因型及药敏试验比较
• 4.3.2 供体菌与接合子的质粒轮廓分析
• 4.4 tetM的基因环境
• 4.4.1 上游序列及下游序列的PCR扩增结果
• 4.4.2 测序结果与分析
• 4.5 tetA的基因环境
• 4.5.1 pBluescriptⅡSK（+）-tetA重组质粒双酶切结果
• 4.5.2 测序结果及分析
• 4.6 Eric PCR结果
• 4.6.1 Eric PCR 扩增结果
• 4.6.2 细菌进化树的构建
• 4.6.3 细菌耐药模式和基因型之间的关系
• 5 讨论与分析
• 5.1 分离菌株四环素类耐药基因的检测
• 5.2 耐药基因的质粒接合传递
• 5.3 tetM和tetA的基因环境
• 5.4 ERIC-PCR进化分析
• 6 结论
• 参考文献
• Abstract