海水淹溺兔肺泡巨噬细胞TNF-α mRNA的动态表达及地塞米松干预作用

论文摘要

海水淹溺（Sea water drowning）不仅常发生于航海事故、海上作业、海上旅行等,而且是军队海上训练和作战减员的重要原因[1]。海水淹溺可导致急性肺损伤（acute lung injury,ALI）,严重者可发展为海水型呼吸窘迫综合征（sea water respiratory distress syndrome, SW-RDS）,病情严重,救治极为困难[2]。因此,研究海水型ALI的早期救治,并防止其向SW- RDS转化,具有重要的意义。有学者报道地塞米松可以减轻海水淹溺后急性肺损伤,但具体机制尚不明确[3-4]。普遍认为TNF-α是导致ALI/ARDS的启动因子[5-7],而海水淹溺后TNF-αmRNA的动态表达及地塞米松对海水淹溺后巨噬细胞内TNF-α分子表达的影响尚未报道。本研究试图阐明TNF-α在SW-RDS发病机制中的作用,探索地塞米松对海水型ALI的治疗机制。目的:通过向兔气管内灌注海水,模拟海水淹溺后导致ALI生理过程,在灌注后不同时点观察AM内TNF-αmRNA的动态表达,并应用地塞米松（Dexamethasone , Dex）进行干预,探讨地塞米松对海水淹溺急性肺损伤的治疗作用及相应的机制。方法:1.实验分组健康新西兰大耳兔40只（第四军医大学动物实验中心提供）,体重（2.50±0.36）kg。为观察海水淹溺后肺泡巨噬细胞（AM）内TNF-αmRNA的动态表达,25只兔随机分成5组:海水淹溺后0min（正常对照组）、30、60、90、120min时点组;为了解地塞米松对海水淹溺后AM内TNF-αmRNA表达的影响,15只兔随机分为3组（每组5只）:①对照组（Control group,C组）:仅作气管插管,不作其他处理;②海水淹溺组（Model group,M组）:制备动物模型,以等量生理盐水代替地塞米松静脉注射。③地塞米松治疗组（Treatment group,T组）:模型建立后立即静脉注射地塞米松2mg/ kg ,随即以（1mg·kg - 1·h - 1）静脉维持。2.建立海水淹溺家兔急性肺损伤模型3.动脉血气分析各组均于手术或模型建立后0min、30min、60min、90min、120min经左侧股内动脉采集0.5ml动脉血注入抗凝试管用于动脉血气分析,采血0.6ml,血气分析由第四军医大学唐都医院血气/肺功能室测定。4.支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集:25只时点组兔于上述各时点放血处死,C组、M组、T组于100分钟放血处死,随后开胸、夹闭气管取全肺。左侧肺叶作肺泡灌洗:生理盐水以5 ml/次,共10 ml,回收率70%左右。5.肺组织的离体观察分别于致伤后0min、30min、60min、90min、120min分批处死家兔,取肺组织,观察肺脏的肉眼变化,并使用数码相机拍照记录。肺组织含水量测定:采用干湿重称重法测定::取得右肺上、中叶,称取肺湿重（W） ,而后置于100℃恒温烤箱内48h至重量恒定后称肺干重（D） ,肺含水量=（肺湿重-肺干重）/肺干重。取左肺下叶组织称重标记,冷冻保存于-70℃环境。测量肿瘤坏死因子a（TNF-a）、IL-10的含量。各组于右下叶同等部位取0.5g肺组织置于10%福尔马林溶液中,固定组织块,经石蜡包埋切片,HE染色后,观察组织病理学改变。6.肺泡巨噬细胞的分离和培养将支气管肺泡灌洗液1 000 r/min离心10 min,沉淀用D-Hank液洗涤,以RPMI-1640悬浮后,置25 mL玻璃细胞培养瓶中,于37℃、5%二氧化碳、PH 7.2条件下培养4小时,等AM黏附于玻璃表面,再用培养液冲洗掉未黏附的中性粒细胞和淋巴细胞等,分离纯化的AM以瑞氏染色证实为巨噬细胞,纯度>95%,台盼蓝染色鉴定细胞活力>90%。7.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测兔肺泡巨噬细胞内TNF-a mRNA表达结果（1）血气分析结果显示, PE-SWD模型建立后, 60min时, PaO2降低到到最低点（31.6±4.98mmHg, 1mmHg=0.133 kPa）后逐渐升高,到120分钟再次降低;PCO2在30min升至最高点,后逐渐回复,可能与家兔代偿性过度通气有关;PH值和D/W在模型建立后进行性下降。（2）病理学检查结果显示:大体标本可见海水淹溺后双肺表面散在暗红色片状区及点状出血区,以双下肺背侧为主,呈“红色肝样变”,肺组织切面及气管腔内有中量血性粉红色泡沫样液体渗出。以地塞米松治疗后的T组亦可见基本相同的肺损伤区域,但总体颜色较淡。HE染色（×100倍）下,M组可见肺泡及肺间质水肿明显,肺出血、肺泡隔断裂,肺泡腔及微血管中大量炎症细胞（主要为中性粒细胞）浸润,肺损伤程度严重;而T组肺泡扩张、水肿明显,肺泡腔及间质内炎症细胞浸润较轻,肺损伤程度较M组减轻。（3） RT-PCR方法检测海水淹溺后家兔AM内TNF-αmRNA的表达即开始上升,随时间增加逐渐增高.90分钟左右达到高峰,之后轻微下降,但仍明显高于正常对照组（P<0.01）。C组AM中TNF-αmRNA仅有轻微表达,M组显著升高（P<0.01）:T组显著低于M组（P<0.05）。结论:1.本实验结果表明兔PO2、PH进行性下降,提示肺换气功能受损严重,符合ALI/ARDS诊断标准,表明海水淹溺致急性肺损伤兔模型构建成功。2. SW-RDS家兔肺泡巨噬细胞中TNF-a mRNA的表达水平在模型建立后即开始升高（P<0.01）,说明SW-RDS原因可能与肺泡巨噬细胞内TNF-αmRNA高表达有关;对SW-RDS动物模型AM中TNF-αmRNA的动态分析,提示急性肺损伤时TNF-a mRNA主要在肺泡巨噬细胞内表达,且与急性肺损伤程度相关。3.本实验以地塞米松治疗患SW-RDS的家兔后,病理结果显示T组兔肺水肿情况较M组轻微而且回复较快,同时T组AM中TNF-αmRNA显著低于M组,说明地塞米松可降低海水淹溺兔急性肺损伤肺泡巨噬细胞TNF-αmRNA的高表达,减轻PE-SWD肺损伤程度,达到对急性肺损伤的治疗。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前 言
• 文 献 回 顾
• 正文
• 实验材料
• 1. 实验动物
• 2.主要试剂
• 3.主要仪器
• 实验方法
• 第一部分 观察海水淹溺后兔肺泡巨噬细胞内TNF-α mRNA 的动态表达
• 结果
• 第二部分 观察地塞米松对海水淹溺肺损伤兔的治疗作用
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢