嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶酶学特性研究

论文摘要

L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸,在自然界中可游离存在,而自然界中不存在游离的D-丙氨酸。D-丙氨酸广泛存在于细菌细胞壁的肽聚糖中,以D-丙氨酰-D-丙氨酸的形式参与肽聚糖层的合成。丙氨酸消旋酶具有催化L-丙氨酸和D-丙氨酸相互转化的作用,属于5’-磷酸吡哆醛（PLP）依赖型,归类于异构酶家族。该酶通过消旋反应为细菌细胞壁的合成提供必要的D-丙氨酸,是原核生物必不可少的一类酶蛋白。此外,丙氨酸消旋酶对抑制芽胞杆菌的孢子萌发具有关键作用。丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关。因此基于丙氨酸消旋酶的分子机制寻找酶的抑制剂,已成为抗生素药物研制的靶标而被广泛研究。本研究从专性嗜碱芽胞杆菌（Alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4）中克隆获得一个长约1100bp的丙氨酸消旋酶基因（dadXOF4）的开放阅读框,该基因通过营养缺陷性实验证明了其具有丙氨酸消旋酶的催化活性。经过基因的克隆、重组质粒的构建、目的蛋白的原核表达及亲和层析纯化、分子筛层析获得了单一的酶蛋白溶液。通过对酶学特性的研究,测得该蛋白分子量约为41kDa,最适pH值为10.5,最适反应温度为40℃,且底物特异性专一,在最适条件下对底物L-丙氨酸的亲和常数Km为41.79mM,Vmax为10500units/mg,对底物D-丙氨酸的Km为14.79 mM,Vmax为3708 units/mg。将其与来自腾冲嗜热杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶进行氨基酸序列比对,根据序列比对和结构解析结果,我们选择了N175、V237、I350、Y352共4个位点作为定点突变位点,分别将175位的极性的天冬酰胺突变为酸性的谷氨酸（E175）；237位的非极性的氨基酸缬氨酸突变为酸性的谷氨酸（E237）；350位的非极性的氨基酸异亮氨酸突变为极性不带电荷的氨基酸丝氨酸（S350）；352位的极性不带电荷的氨基酸酪氨酸突变为非极性的氨基酸苯丙氨酸（F352）。通过对突变体蛋白的酶学特性分析发现：突变体OFdadX-N175E最适反应pH为9.6,OFdadX-V237E最适反应pH为11,OFdadX-I350S最适反应pH为12；突变体OFdadX-N175E最适反应温度为30℃、OFdadX-V237E最适反应温度为30℃、OFdadX-I350S最适反应温度为40℃。稳定性试验结果显示所获得的4个突变体中突变N175E和I350S的热稳定性和pH稳定性比野生型有所降低。Y352F的底物特异性除最适底物与野生型相同外,其它底物差异较明显。选定pH稳定性减弱的N175E位点进行饱和突变,构建饱和突变文库,并通过Microplate reader筛选得到活性进一步提高的突变体N175S、N175D、N175R,并经亲和层析纯化得到单一蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 丙氨酸消旋酶生物学特点
• 1.2 不同菌种来源的丙氨酸消旋酶
• 1.2.1 含有两个不同的丙氨酸消旋酶
• 1.2.2 含单一丙氨酸消旋酶
• 1.3 丙氨酸消旋酶的结构解析
• 1.4 丙氨酸消旋酶的PLP依赖性
• 1.5 丙氨酸消旋酶的表达纯化方法及纯化效率
• 1.6 丙氨酸消旋酶活性的测定方法
• 1.6.1 D-氨基酸氧化反应法测定丙氨酸消旋酶的活性
• 1.6.2 测定酶动力学参数的方法测丙氨酸消旋酶活性
• 1.6.3 根据旋光值吸收变化测定消旋酶的活力
• 1.7 展望
• 第二章 专性嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶基因在大肠杆菌中的表达与纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 丙氨酸消旋酶基因克隆及载体构建
• 2.2.2 丙氨酸消旋酶基因序列及比对
• 2.2.3 丙氨酸消旋酶基因功能互补实验
• 2.2.4 丙氨酸消旋酶DadXOF4的原核诱导表达
• 2.2.5 丙氨酸消旋酶蛋白纯化及分子量测定
• 2.2.6 辅酶PLP依赖性
• 2.2.7 测定酶蛋白动力学参数
• 2.3 小结
• 第三章 专性嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶基因突变位点选择、突变体的构建和表达纯化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 工具酶和试剂
• 3.1.2 定点突变引物设计
• 3.1.3 重叠延伸法定点突变
• 3.1.4 蛋白的诱导表达和纯化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 丙氨酸消旋酶突变位点的选择
• 3.2.2 含有突变位点的表达质粒的构建
• 3.2.3 突变体基因的测序及序列比对结果
• 3.2.4 突变体蛋白营养缺陷性互补实验
• 3.2.5 突变体酶蛋白纯化结果
• 3.3 小结
• 第四章 嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶野生型及突变体的酶学特性的比较研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 本研究所用材料与试剂
• 4.1.2 试验方法操作
• 4.2 实验结果与分析
• 4.2.1 丙氨酸消旋酶蛋白最适反应温度
• 4.2.2 丙氨酸消旋酶蛋白最适反应pH
• 4.2.3 丙氨酸消旋酶底物特异性研究
• 4.2.4 丙氨酸消旋酶蛋白热稳定性结果
• 4.2.5 丙氨酸消旋酶蛋白pH稳定性结果
• 4.3 小结
• 第五章 饱和突变文库的构建与筛选
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 工具酶和试剂
• 5.1.2 试剂盒法全质粒饱和突变PCR
• 5.1.3 大肠杆菌电转感受态的制备
• 5.1.4 饱和突变产物的电转化
• 5.1.5 饱和突变库的构建与筛选
• 5.1.6 阳性突变体的纯化
• 5.1.7 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
• 5.1.8 野生型及突变体酶学性质的测定
• 5.2 实验结果与分析
• 5.2.1 饱和突变库的筛选与序列比对
• 5.2.2 突变体粗酶相对酶活力的比较
• 5.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果清单