论文摘要
目的构建含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescence Protein,EGFP）基因和白细胞介素10（Interleukin 10,IL10）-肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）重组融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-IL10-HGF,验证其在T6大鼠肝星状细胞中的表达。方法从人单核细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增IL10基因编码区序列,以克隆载体pUC-SRα/HGF为模板PCR扩增HGF基因编码区序列,将二者纯化片段连接进入pGEM-T-Easy克隆载体,转化Top10感受态大肠杆菌,氨苄青霉素及蓝白斑筛选,酶切及DNA测序鉴定得到阳性克隆。以上述克隆载体为模板采用重组PCR技术扩增得到IL10-HGF（LH）融合基因序列,将纯化片段连接进入pGEM-T-Easy克隆载体,氨苄青霉素及蓝白斑筛选,酶切及DNA测序鉴定得到阳性克隆。双酶切定向克隆构建pEGFP-N1-LH,转化Top10感受态大肠杆菌,卡那霉素筛选,酶切及DNA测序鉴定得到阳性克隆。提取pEGFP-N1-LH及pEGFP-N1质粒;采用脂质体介导法瞬时转染T6细胞,G418筛选获得真核载体稳定表达细胞系,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白亚细胞定位, RT-PCR及Western验证LH基因转录及蛋白表达。结果酶切与测序证实克隆质粒中含有IL10、HGF、LH基因编码区;酶切和测序证实重组真核表达质粒中含有LH融合基因编码区序列且插入方向正确;荧光显微镜观察转染了pEGFP-N1和pEGFP-N1-LH的T6细胞中可以看到增强型绿色荧光蛋白的表达,EGFP亚细胞定位在全细胞,LH主要定位在细胞质,RT-PCR及Western结果表明重组LH在T6细胞中稳定表达。结论成功克隆了IL10、HGF及LH基因编码区序列,构建了以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-LH,pEGFP-N1-LH在T6细胞中稳定表达成功。