重组人凋亡素2配体Ⅰ期临床及相关实验研究

论文摘要

凋亡素2配体（Apo-2 ligand，Apo2L），或称肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL），是近年来发现的肿瘤坏死因子家族新成员，它通过与细胞表面相应的死亡受体相结合，启动凋亡的信号传导，能选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常组织无明显损伤，因而成为目前细胞凋亡领域抗肿瘤药物的研究热点。基于Apo2L／TRAIL独特的作用机制、重组人可溶性Apo2L／TRAIL临床前体现出的广谱的抗肿瘤作用和良好的安全性、以及内源性血管生成抑制因子抗肿瘤研究进展，本课题开展了下述两方面的研究：①国产重组人凋亡素2配体（rh-Apo2L）的Ⅰ期临床研究；②人Apo2L／TRAIL与人血管生成抑制因子融合表达的基础研究。第一部分：重组人凋亡素2配体（rh-Apo2L）的Ⅰ期临床研究目的：观察晚期恶性肿瘤病人对rh-Apo2L静脉滴注后的耐受性；测定该药在人体的药代动力学主要参数；初步观察其抗肿瘤疗效；提出Ⅱ期临床研究合理的剂量及方案。方法：符合招募标准并签署知情同意书的晚期恶性肿瘤志愿者，首先接受rh-Apo2L皮试，皮试阴性者才能接受rh-Apo2L治疗；按“3+3”原则进行剂量爬坡，每组3～6例。研究方案为，rh-Apo2L溶于250毫升0.9％生理盐水中，静脉滴注2小时，每天一次，连用14天（d），观察14天，28天为一周期。根据耐受性研究结果，选择患者取血清采用“Sandwich ELISA”方法，进行单次或连续给药的药代动力学研究。结果：入组患者22例，2例皮试阳性退出研究，20例完成剂量爬坡和耐受性研究。rh-Apo2L给药由10μg／Kg／d爬坡至300μg／kg／d共6个剂量组，具体为10μg／Kg／d、30μg／kg／d、100μg／kg／d、150μg／kg／d、200μg／kg／d、300μg／kg／d。耐受性研究显示，rh-Apo2L的毒性反应轻微。除300μg／kg／d剂量组出现Ⅲ度全身炎性反应综合征，其余均为Ⅰ～Ⅱ度不良反应，包括发热、疲劳、乏力、皮肤粘膜改变、消化道反应、心血管系统毒性、骨髓抑制和肝肾功能损伤。所有毒副反应均在停药2周内恢复。未出现过敏性休克和药物相关死亡。19例可评价疗效，13例（68％）为稳定，6例（32％）为进展。四个剂量水平（30μg／kg／d、100μg／kg／d、150μg／Kg／d、200μg／kg／d）共18例次患者，进行了单次或连续给药的药代动力学研究。结论：rh-Apo2L静脉滴注后的耐受性良好，剂量限制性毒性（DLT）是全身炎性反应综合征；最大耐受剂量（MTD）为200μg／kg／d；rh-Apo2L静脉滴注符合二室模型药动学分布特性和线性动力学特征。Ⅱ期临床研究推荐方案为150μg／kg／d×14d（该剂量水平已超过动物实验中显示出的有效剂量），28天为一周期。第二部分：人Apo2L／TRAIL与人血管生成抑制因子融合表达的研究目的：将不同来源的内源性血管生长抑制因子——人凝血系统分子kininogen来源的片断kininostatin、人细胞内蛋白calreticulin来源的片断vasostatin及人Ⅳ型胶原α2链C末端来源的canstatin，分别与人Apo2L／TRAIL进行融合表达，通过初步生物学活性观察，从中筛选出双功能蛋白——即特异地抑制肿瘤组织新生血管形成和杀伤肿瘤细胞的分子。方法：实验根据内源性血管生长抑制因子kininostatin、vasostatin、canstatin与Apo2L／TRAIL的编码序列，设计相应引物；分别以包含这些分子的编码序列的质粒为模板，用两轮聚合酶链反应（PCR）（即SOEing法）扩增出通过氨基酸连接臂（Linker，氨基酸序列为GGGSGGSG）连接的编码融合蛋白的DNA序列；相应的融合基因插入原核表达载体pBV220中，得到各融合蛋白重组表达质粒；将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21，筛选出含重组质粒的克隆，42℃热诱导表达，获得一系列融合蛋白：A-K（Apo2L-Kininostatin），K-A（Kininostatin-Apo2L），A-V（Apo2L-Vasostatin），V-A（Vasostatin-Apo2L），A-C（Apo2L-Canstatin），C-A（Canstatin-Apo2L）；分析、鉴定和纯化所表达的重组融合蛋白后，通过肿瘤细胞株SW1990和NCI-H460的杀伤实验、内皮细胞ECV304增殖抑制实验、以及ECV304细胞管腔形成抑制实验，分析融合蛋白的生物学活性，以筛选出具有最强抗肿瘤作用的双功能的分子。结果：6种融合蛋白在原核表达系统中都得到了表达；K-A（Kininostatin-Apo2L）和V-A（Vasostatin-Apo2L）融合蛋白基本保持着Apo2L／TRAIL杀伤肿瘤细胞的活性；融合蛋白也增强了Apo2L／TRAIL对ECV304的杀伤作用，从而确定了融合蛋白中血管生长抑制因子的生物学活性；通过管腔形成实验也证实了K-A、V-A的新生血管生长抑制作用。结论：本部分工作，在原核表达系统中高效重组表达了一系列血管生长抑制因子与Apo2L／TRAIL融合的蛋白，其中部分融合蛋白在内皮细胞增殖抑制实验中表现出抑制内皮细胞增殖的作用；在血管生成实验中，表现出抑制内皮细胞生长和抑制血管形成的作用，这些可能为血管生长抑制因子与凋亡诱导因子的双功能融合蛋白开发成新的抗肿瘤药物打下了基础。

论文目录

• 英文缩写对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分
• 背景
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附表
• 参考文献
• 第二部分
• 背景
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢