为建立高效肝特异性条件性基因剔除小鼠所设计的转录和酶活性水平上对Cre重组酶的严谨双重调控系统

论文摘要

随着人类基因组图谱的完成,以诠释活体内基因功能的研究已经大规模地启动,特别是那些与疾病相关的基因的研究更受重视。建立组织特异性基因打靶的小鼠品系已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。基于同源重组原理,运用Cre/IoxP位点特异性重组酶系统的基因打靶技术,通过建立转基因小鼠家系,既可以通过定点切除基因以进行基因功能失去方面研究又可特异性地在多种组织以及胚胎干细胞基因组中引入预定的突变,以研究该基因的功能及其与相关疾病发生、发展的关系,因而是建立功能基因组模型以及人类疾病动物模型的主要途经。肝癌是最常见的人类恶性肿瘤之一,而我国的肝癌发生率和死亡率均居世界之首。但迄今为止对于肝癌的发生发展机制知之甚少,缺乏早期诊断及特异性治疗的手段。目前,虽然可诱导组织特异性Cre/IoxP系统被逐渐完善并且越来越多的特定组织肿瘤基因剔除小鼠模型被建立,然而该系统仍然存在靶基因的渗漏表达及在生殖细胞中敲除发育相关基因造成胚胎致死等缺点,造成目前仍没有肝特异性的肿瘤小鼠模型被建立,从而阻碍了对肝癌的发病原因及治疗方案研究的深入。为了能建立肝癌小鼠模型且更深入地探讨肝癌的发病机制,本课题将构建一个转录和翻译后双重水平调控肝特异性表达的Cre重组酶系统:第一,运用肝特异性启动子Promoter of C/EBPβ调控Tet-off诱导系统中四环素激活蛋白的表达,从而在转录水平上调控Cre重组酶的表达;第二,应用Tamoxifen激活系统以蛋白间相互作用方式在翻译后水平上对Cre重组酶活性进行调控。并且在细胞水平上检测了该系统中Cre重组酶的肝特异性表达及其活性受调控情况。该系统的转基因小鼠的建立将为进一步的肝特异性基因剔除小鼠的建立,以及肝癌小鼠模型的建立提供有力的技术手段。肿瘤特异性增殖病毒（溶瘤病毒）以及以抑癌基因为基础的基因治疗是颇具潜力的抗肿瘤治疗手段。然而却很少有在临床上成功应用的例子,其主要原因是缺乏一个高表达,高特异性且高安全性的载体。肿瘤抑制蛋白p53是一种具有双重功能的转录因子,它既能上调抑制细胞增殖及诱导凋亡相关蛋白的表达,同时p53还能通过与转录机制中基础元件的相互作用来抑制某些基因的转录。基于肿瘤细胞中p53功能缺失的特点,我们构建了一个基因治疗载体,能够实现治疗基因,手艮告基因在肿瘤细胞中特异高表达,而在正常细胞中表达水平极低。首先,将肿瘤细胞中特异高活性且可被p53抑制的肿瘤特异性人造启动子置于治疗基因/报告基因上游,用于控制其表达,因此治疗基因能够在肿瘤细胞中有高水平的表达;同时,在治疗基因/报告基因的下游反向插入一个可被p53激活的启动子,以启动反向转录从而反义链可与正义链互补配对形成双链RNA（dsRNA）阻碍正义链的翻译,用于进一步降低治疗基因/报告基因在正常细胞中的表达。我们在细胞水平上运用瞬时转染报告基因系统验证了双向启动子对蛋白表达的调控,同时也运用该系统改造腺病毒载体,调控腺病毒复制增殖所必需的E1A蛋白的表达,以期构建一个在肿瘤细胞中高活性且高特异性的溶瘤腺病毒。

论文目录

• 第一部分 为建立高效肝特异性条件性基因剔除小鼠所设计的转录和酶活性水平上对Cre重组酶的严谨调控系统
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 以抑癌基因p53的转录调控缺陷为基础的治疗基因的肿瘤特异性表达双重调控技术平台的完善
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述 Cre/loxP应用于组织特异性条件性可控的转基因小鼠的策略
• 致谢