大豆7S、11S蛋白酶解模拟分析及疏水性对抗氧化活性的影响

论文摘要

本文研究了“活性肽搜寻与蛋白模拟酶解”程序对蛋白质的模拟酶解与实验结果的相关性,并利用大孔吸附树脂的分级技术分析水解产物疏水性与抗氧化活性的关系,最后经凝胶过滤层析、反相高效液相色谱及液相-质谱联用获得了具有较强抗氧化活性的组分序列,进一步讨论了模拟酶解预测抗氧化肽的可行性及疏水性对肽的抗氧化活性的影响。论文主要研究结论如下:以“活性肽搜寻与蛋白模拟酶解”程序为工具,对大豆7S、11S蛋白进行模拟酶解,根据实验酶解产物分子量分布对模拟结果进行分析。结果表明:碱性蛋白酶Alcalase和中性蛋白酶酶解产物水解度较高（DH>30%）,实验结果与模拟酶解所得片段分子量分布在重均分子量上线性关系显著（P<0.01）,相关性较好（r=0.9790.999）;胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物因水解度较低（DH<20%）,与模拟结果存在一定差异。采用DA201-C型大孔吸附树脂对7S碱性蛋白酶水解产物进行吸附,以不同浓度乙醇进行梯度洗脱,测定各洗脱组分的氨基酸组成和抗氧化活性,并计算平均疏水性Q值。结果显示:组分平均疏水性Q值随着乙醇浓度的提高而升高;DPPH·自由基清除能力、Fe2+螯合能力以及亚油酸过氧化抑制能力与平均疏水性呈显著正相关（P<0.010.05）,还原力与平均疏水性相关性不显著（P>0.05）。利用Sephadex G-15凝胶过滤层析、半制备RP-HPLC对水解物进行分离纯化,经LC-MS鉴定得到12个氨基酸序列,分别为GCGF、QPEN、YGALQ、NP、EGTNNP、YGSL、VPAGCT、EGAF、AY、LLYA/LIYA/IIYA/PEYA、WIY/WLY和WF,其中9条序列在大豆7S蛋白序列中找到相同或相似的片段,1条序列为已证实的抗氧化肽,数条序列与已知抗氧化肽有着类似结构或氨基酸组成,说明模拟酶解蛋白分析预测抗氧化肽具有一定的可行性。通过计算12个肽段的疏水性Q值并比较其抗氧化活性,结果表明亚油酸过氧化抑制能力与其疏水性Q值呈显著正相关（P<0.01）,疏水性Q值较高组分的DPPH·自由基清除能力明显强于较低的组分（P<0.05）,因此可以推断肽的抗氧化活性与其疏水性存在正相关性,随着疏水值的增大,肽的抗氧化活性有一定程度的增强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 生物活性肽
• 1.2 疏水性与生物活性肽
• 1.3 抗氧化肽的研究进展
• 1.3.1 抗氧化肽
• 1.3.2 抗氧化肽的作用机理
• 1.3.3 抗氧化能力的体外评价方法
• 1.3.4 抗氧化肽的分离纯化与结构鉴定
• 1.4 大豆贮藏蛋白和抗氧化肽蛋白源
• 1.5 计算机模拟蛋白酶解的研究现状
• 1.6 立题意义及研究内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验原料及主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大豆7S、11S 蛋白的模拟酶解分析
• 2.2.2 大豆7S、11S 蛋白的提取
• 2.2.3 成分分析
• 2.2.4 大豆7S、11S 蛋白的酶法水解
• 2.2.5 蛋白浓度的测定
• 2.2.6 水解度的测定
• 2.2.7 抗氧化活性的测定
• 2.2.8 分子量分布的测定
• 2.2.9 氨基酸组成分析
• 2.2.10 蛋白质或多肽疏水值的计算
• 2.2.11 DA201-C 大孔吸附树脂对水解物分级实验
• 2.2.12 Sephadex G-15 凝胶过滤层析分离
• 2.2.13 半制备RP-HPLC 分离
• 2.2.14 LC/MS 液质联用分析
• 2.2.15 数据处理与统计分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 大豆7S、11S 蛋白模拟酶解与实验比较
• 3.1.1 大豆7S、11S 蛋白的模拟酶解
• 3.1.2 大豆7S、11S 蛋白的实验酶解
• 3.2 DA201-C 大孔吸附树脂对水解产物的分级实验及抗氧化活性的比较
• 3.2.1 DA201-C 大孔吸附树脂对水解物的分级实验
• 3.2.2 DA201-C 大孔树脂分级组分抗氧化活性的比较
• 3.2.3 各组分疏水性Q 值与抗氧化活性的关系
• 3.3 水解产物的分离纯化及结构鉴定
• 3.3.1 Sephadex G-15 凝胶层析分离
• 3.3.2 半制备RP-HPLC 分离
• 3.3.3 LC-MS 分析组分结构
• 3.3.4 疏水性对抗氧化活性的影响
• 论文主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：模拟与实验水解产物分子量分布
• 附录2：作者在攻读硕士学位期间发表的论文