盐酸去氧肾上腺素和丝裂霉素对体外培养兔角膜内皮细胞的毒性影响

论文题目: 盐酸去氧肾上腺素和丝裂霉素对体外培养兔角膜内皮细胞的毒性影响

论文类型: 硕士论文

论文专业: 眼科学

作者: 王爱莲

导师: 刘瑶

关键词: 盐酸去氧肾上腺素,丝裂霉素,角膜内皮细胞,细胞培养,药效作用

文献来源: 东南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 【目的】观察盐酸去氧肾上腺素和丝裂霉素（MMC）对体外培养家兔角膜内皮的作用,探讨临床应用这两种药物的可能毒性作用。【方法】显微分离兔角膜后弹力层-内皮细胞层,联合贴壁法和（或）消化法培养角膜内皮细胞,利用含小牛血清的高糖DMEM作为培养液,不添加生长因子。培养的角膜内皮细胞,传代接种于96孔板,盐酸去氧肾上腺素设定为4个实验组0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml,4个相应阴性对照组;MMC分为6个实验组1×10-6mg/ml、1×10-5mg/ml、1×10-4mg/ml、1×10-3mg/ml、1×10-2mg/ml、1×10-1mg/ml,均设空白对照2组。不同时相相差倒置显微镜下观察细胞的形态变化和增殖情况,去氧肾上腺素组于加药72h后,MMC组于加药22h后MTT法检测各组细胞增殖情况,对比不同浓度组细胞吸光度并进行统计学处理。去氧肾上腺素组再次设定4个实验组0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml,在加药后5min、10min、30min、1h、1h30min更换实验组的培养液,进一步观察细胞的空泡变性能否逆转。【结果】培养的兔角膜内皮细胞呈单层密集生长,形态为六角形或多边形,具有活体细胞的形态特征。去氧肾上腺素5mg/ml实验组加药4h后细胞出现空泡,2.5mg/ml组加药5h后细胞出现空泡,1.25mg/ml组加药后10h出现明显空泡,加药12h后3个实验组均显示明显空泡,30h后2.5mg/ml、5mg/ml实验组细胞部分死亡,60h后1.25mg/ml、2.5mg/ml实验组原空泡变细胞大部分死亡,72h后3个浓度组几乎全部死亡。0.625mg/ml浓度组和4个阴性对照组均未出现形态学变化。1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml实验组细胞吸光度值与空白及阴性对照的差异经统计学分析有极显著意义（P<0.001）;0.625mg/ml试验组、4个阴性对照组与空白对照组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。去氧肾上腺素接触内皮细胞后,5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml浓度组5min以内换液,细胞均未出现空泡变,加药后6h再次换液,已出现的细胞空泡变性减轻,所有换液复孔细胞均未死亡。MMC组:加药后1h、2h、3h、5h各组细胞形态变化不明显,1×10-2mg/ml、1×10-1mg/ml实验组8h后细胞部分变圆,20h后细胞几乎全部变圆死亡,其余各组变化不明显。1×10-6mg/ml、1×10-5mg/ml组和空白对照组经统计学分析差异无显著性（P>0.05）,1×10-4组和空白对照组比较差异有显著性（P<0.05）,1×10-3mg/ml、1×10-2mg/ml、1×10-1mg/ml组和空白对照组比较有极显著差异（P<0.001）。【结论】盐酸去氧肾上腺素和丝裂霉素对体外培养兔角膜内皮细胞有损伤作用,并有时间和浓度相关性。尽早和及时的换液可避免或减轻盐酸去氧肾上腺素对角膜内皮细胞的毒性作

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

文献综述

1 角膜内皮细胞的生理功能和特点

2 角膜内皮细胞的培养

2.1 角膜内皮细胞培养方法

2.1.1 机械刮取法

2.1.2 组织块培养法

2.1.3 酶消化法

2.1.4 显微分离后弹力层-内皮细胞层联合贴壁法

2.1.5 显微分离后弹力层-内皮细胞层联合消化法

2.2 角膜内皮细胞培养液

3 生长因子和角膜内皮细胞的关系

3.1 EGF(表皮生长因子)

3.2 PDGF(血小板源性生长因子)

3.3 FGF (成纤维细胞生长因子)

3.4 其它生长因子

4 角膜内皮细胞的移植

4.1 直接向前房内注入培养的角膜内皮细胞

4.2 培养的角膜内皮细胞接种在去除了自身内皮细胞层的供体角膜后弹力层上

4.3 将培养的角膜内皮细胞接种在载体上,然后将载体与去除自身内皮细胞层 或后弹力层的角膜一起行穿透角膜移植术

4.4 带后板层角膜或带后弹力膜的内皮细胞移植

4.4.1 带后板层角膜的内皮细胞移植[21]

4.4.2 带后弹力膜的内皮细胞移植

5 应用三维培养技术体外重建角膜组织

6 利用培养角膜内皮细胞进行实验研究

6.1 常见药物对角膜内皮细胞的影响

6.2 常见疾病、手术对角膜内皮细胞的影响

6.3 其它常见因素

7 角膜内皮细胞的研究前景

材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 主要试剂

1.1.3 培养液、试济的配制

1.1.4 仪器

1.2 实验方法

1.2.1 角膜内皮细胞培养方法

1.2.1.1 角膜片的取材

1.2.1.2 细胞的分离和培养

1.2.1.3 细胞的传代培养

1.2.1.4 培养细胞的观察

1.2.2 盐酸去氧肾上腺素和丝裂霉素对角膜内皮细胞毒性影响的观察

1.2.2.1 MMC 的毒性作用

1.2.2.2 盐酸去氧肾上腺素的毒性作用

1.2.2.3 加药后不同时间更换去氧肾上腺素实验组的培养液,进一步观察该药引起的细胞 空泡变性有无好转

1.2.3 统计学处理方法

实验结果

2.1 细胞培养结果

2.1.1 取材过程观察

2.1.2 培养角膜内皮细胞的形态学观察

2.1.2.1 原代培养

2.1.2.2 传代培养

2.2 去氧肾上腺素对角膜内皮细胞的影响

2.2.1 不同时相倒置显微镜下观察去氧肾上腺素对角膜内皮细胞形态的影响

2.2.2 MTT 法测各组吸光度,对比细胞增殖情况

2.2.3 因病理上空泡变性具有可逆性,在不同时间更换实验组的培养液,进一 步观察细胞的空泡变性有无好转

2.3 丝裂霉素对角膜内皮细胞的影响

2.3.1 不同时相相差倒置显微镜下观察丝裂霉素内皮细胞形态的影响“附录 1 原始照片” 加药后 1h、2h、3h、5h:细胞形态变化不明显

2.3.2 MTT 检测吸光度,对比细胞增殖情况

讨论

3.1 角膜内皮细胞的培养

3.1.1 角膜内皮细胞的生物学特性

3.1.2 角膜内皮细胞培养的方法

3.1.3 培养的角膜内皮细胞生物学特性

3.1.4 培养角膜内皮细胞鉴定

3.1.5 细胞毒性检测方法

3.2 盐酸去氧肾上腺素对角膜内皮细胞的毒性作用

3.3 丝裂霉素对角膜内皮细胞的毒性作用

3.4 展望

结论

致谢

参考文献

附录1 原始照片

附录2 在学期间发表的论文

发布时间: 2007-06-11

参考文献

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