奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解细菌的分离鉴定及其产酶研究

论文摘要

我国具有丰富的秸秆资源,但用来做家畜饲料的仅占15%-20%,大部分秸秆被丢弃或烧掉,这是一种巨大的资源浪费。同时,农作物秸秆在作为粗饲料利用过程中还存在着营养缺陷:家畜采食量低,体内消化率低,养分不平衡（低N、低Ca、低P、低葡萄糖物质）,导致我国奶牛单产水平低,淘汰率高,制约了我国奶牛养殖效益提高。运用微生物发酵技术处理秸秆,提高粗饲料中的蛋白质和碳水化合物含量,被认为是解决上述问题的有效方法。研究人员利用纤维素分解菌及其复合菌制剂发酵秸秆,发现能够降低秸秆中的纤维素含量而提高蛋白质和碳水合物含量。奶牛瘤胃中存在大量的能够分解纤维素的微生物,其中严格厌氧的纤维素分解菌在国外得到了深入的研究,但兼性厌氧的纤维素分解菌的研究还很少。由于兼性厌氧细菌能够适应饲料微贮过程中初始阶段有氧,后期无氧的环境,因此兼性厌氧纤维素分解菌作为粗饲料添加剂更具有优势。本研究的目的是从奶牛瘤胃液中分离出具有分解纤维素能力的兼性厌氧细菌,用于绿色粗饲料微生物添加剂研制。研究分为两个部分:第一部分奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解菌的分离鉴定从奶牛瘤胃中采取瘤胃液,接种羧甲基纤维素钠平板,采用严格厌氧结合需氧培养方式进行培养。通过刚果红染色,筛选出分解纤维素能力强的兼性厌氧细菌。采用生化试验结合16SrDNA序列分析方法对细菌进行鉴定,并绘制系统发育树。同时对细菌生长特性及有无致病性进行初步测定。实验过程中共分离到63株具有分解纤维素能力的细菌,其中29株有较强的分解纤维能力。24株G-细菌经生化鉴定结合16SrDNA序列分析,18株为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种,3株为铜绿假单胞杆菌,2株为大肠杆菌,1株为产酸克雷伯氏菌。5株G+细菌经16SrDNA序列分析,2株与苏云金芽孢杆菌有99.7%同源性,2株与巨大芽孢杆菌有99.6%同源性,1株与蜡状芽孢杆菌有99.5%的同源性。分类学上可分别归于苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。细菌的生长特性及致病性试验表明,分离到的细菌在20-41℃, pH5-9之间生长良好,肺炎克雷伯氏菌、苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌无致病性。第二部分肺炎克雷伯氏菌和苏云金芽孢杆菌的产纤维素酶研究选取一株G-细菌（2#,肺炎克雷伯氏菌）和一株G+细菌（9#,苏云金芽孢杆菌）进行产酶研究。为了确定细菌的产酶方式,对细菌进行了超声波破碎,测定破碎前后酶活力有无显著差异。为了检测细菌的产酶种类,进行了滤纸酶活力、C1酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和Cx酶活力测定。结果发现,选取的G-和G+细菌产酶情况基本类似。细菌菌液离心后上清液中有较高的滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和Cx酶活力,而C1酶活力很低,并且未经破碎的菌液和经过破碎的菌液离心上清液中酶活力并无明显差异。说明细菌产β-葡萄糖苷酶和内切-β-1,4-葡聚糖酶,并且为胞外酶。细菌菌体有较高的C1酶活力,而上清中C1酶活力很低,且经破碎和未经破碎菌体酶活力无明显差异,说明细菌能产外切-β-1,4-葡聚糖酶。但这种酶游离性比较差,可能粘附在细胞膜或细胞壁上。研究表明:细菌能够产生内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶,并且分泌到胞外。细菌能够产生外切-β-1,4-葡聚糖酶,但该酶难以游离到胞外。细菌的产酶种类比较齐全。筛选到的兼性厌氧纤维素分解菌为粗饲料添加剂的研究提供了基础,有作为绿色粗饲料微生物添加剂的可能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1. 瘤胃纤维素分解菌概况
• 2. 国内外研究进展
• 2.1 国内研究进展
• 2.2 国外研究进展
• 3. 天然纤维素的成分和结构
• 3.1 天然纤维素的主要成分
• 3.2 纤维素的化学结构
• 4. 纤维素酶学性质与酶解机理
• 4.1 纤维素酶学性质
• 4.1.1 内切-1,4-β-葡聚糖酶
• 4.1.2 外切-1,4-β-葡聚糖酶
• 4.1.3 β-葡萄糖苷酶
• 4.2 纤维素酶解机理
• 5. 分解纤维素原料相关酶系的测定方法
• 5.1 纤维素酶溶解活性
• 5.1.1 浊度法
• 5.1.2 透明圈法
• 5.1.3 失重法
• 5.2 滤纸酶糖化活性
• 5.2.1 滤纸酶活性
• 5.2.2 棉花酶活性
• 5.3 纤维素酶各组分酶活力的测定
• 5.3.1 CBH 酶活性
• 5.3.2 EG 酶活性
• 5.3.3 BG 酶活
• 6. 纤维素分解菌的研究展望
• 实验一 奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解菌的分离鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 试验动物
• 1.1.4 奶牛瘤胃液
• 1.2 纤维素分解菌的分离、纯化培养基
• 1.2.1 羧甲基纤维素钠（CMC—Na）培养基
• 1.2.2 加富羧甲基纤维素钠培养基
• 1.2.3 种子液
• 1.3 纤维素分解菌的分离、筛选
• 1.4 细菌的鉴定
• 1.4.1 形态学特征
• 1.4.2 生化鉴定
• 1.4.3 16SrDNA 序列分析法鉴定
• 1.4.3.1 模板 DNA 的提取
• 1.4.3.2 聚合酶链式反应
• 1.4.3.3 PCR 产物电泳
• 1.4.3.4 PCR 产物回收
• 1.4.3.5 DNA 连接反应
• 1.4.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.4.3.7 连接产物的转化
• 1.4.3.8 单克隆细菌的扩增
• 1.4.3.9 质粒 DNA 的提取
• 1.4.3.10 质粒 DNA 的酶切鉴定
• 1.4.3.11 阳性克隆序列测定
• 1.4.4 细菌系统发育树的构建
• 1.5 细菌生长特性测定
• 1.6 细菌致病性测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 细菌的分离
• 2.2 细菌的形态学特征
• 2.3 刚果红染色筛选
• 2.4 细菌的鉴定
• 2.4.1 生化试验结果
• 2.4.2 16SrDNA 序列分析
• 2.5 细菌的生长特性
• 2.6 细菌的致病性
• 3. 讨论与结论
• 3.1 纤维素分解细菌的筛选
• 3.2 粗饲料微生物添加剂
• 3.3 细菌的鉴定
• 实验二 肺炎克雷伯氏菌和苏云金芽孢杆菌产纤维素酶的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 试剂
• 1.1.3.1 浓度为1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液
• 1.1.3.2 3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
• 1.1.3.3 0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液
• 1.1.3.4 0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液
• 1.1.3.5 0.51%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液
• 1.1.3.6 0.5%水杨酸苷溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 纤维素酶粗酶液的制备
• 1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作
• 1.2.3 滤纸酶活力的测定
• 1.2.4 C-1 酶活力的测定
• 1.2.5 Cx 酶活力的测定
• 1.2.6 β-葡萄糖苷酶活力的测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 葡萄糖标准曲线
• 2.2 酶活力测定结果
• 2.3 酶活力与发酵时间的折线图
• 2.4 酶活力分析
• 3. 讨论与小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况