杜彦辉刘君星*（黑龙江佳木斯大学基础医学院154007）
【摘要】目的：观察无镁离子诱导的离体培养海马神经元异常放电时线粒体膜电位变化及甜菜碱的干预作用，初步探讨甜菜碱抑制癫痫可能的作用机制。方法：分离培养Wistar大鼠海马神经元细胞，将海马神经元全液换成无镁细胞液处理3h造成痫性放电模型，以浓度为100μmol/L甜菜碱进行干预，以100μmol/L的γ-氨基丁酸、100mg/L的丙戊酸钠作为对照，各组处理完然后恢复正常培养12h、24h、48h、72后取材。MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测线粒体膜电位并分析细胞凋亡情况。结果：模型组海马线粒体膜电位明显下降(P<0.01)，凋亡发生率增加(P<0.01)，甜菜碱治疗组与模型组相比，海马线粒体膜电位下降(P<0.01)。凋亡发生率增加(P<0.01)。结论:甜菜碱稳定线粒体膜电位的作用较弱，没有降低细胞凋亡率。结论：在离体实验中甜菜碱对痫性放电的海马神经元微弱的保护作用，推测其作用机制可能并不是影响海马神经元的线粒体膜电位。
【关键词】甜菜碱；线粒体膜电位；细胞凋亡；癫痫【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165（2015）09-0000-02
癫痫（epilepsy,EP）是一种常见的慢性脑部疾病，是神经元间歇性异常放电的结果，此类患者绝大多数需要长期乃至终生服用抗癫痫药物(Anti-epilepticdrugs，AEDs)。目前，关于癫痫病理机制的研究和药物开发尽管有了长足的发展;但仍有1/3的癫痫病人为难治性癫痫，需要长期依靠药物来维持，且存在着严重的副作用，中药以其疗效稳定、无明显毒副作用等优势，对癫痫的治疗取得较大进展,中医药治疗癫痫已有数千年历史，积累了丰富经验，大量的动物实验已证实甜菜碱具有抑制癫痫发作的作用，而本实验研究目的是从神经元方面研究甜菜碱的抗癫痫机制，本实验通过测定灵芝生物碱-甜菜碱对离体海马神经元线粒体膜电位及细胞凋亡的影响。探讨灵芝生物碱-甜菜碱对海马神经元异常放电致损伤的保护作用及机制。从而为探讨甜菜碱的药理机制提供依据。
1材料与方法1.1主要材料1.1.1动物与试剂24h内新生清洁级Wistar大鼠，雌雄不限，体重4.5g-6.0g，购自佳木斯大学实验动物中心。Neurobasal培养液，Gibco公司；L-谷氨酰胺，Gibco公司；B-27，Gibco公司；特级胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，Gibco公司；线粒体膜电位检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司。
1.1.2仪器-80℃冰箱，Thermo公司；流式细胞仪，FACSCaliburBecton-Dickinson；酶联免疫检测仪，BioTek公司。
1.2方法1.2.1模型制备和实验分组：我们采用24h内新生Wistar大鼠为细胞源，用Neurobasal培养液培养海马神经元，分离的海马神经元置96孔细胞培养板内，每孔加0.2ml含1×105个/ml分离好的大鼠海马神经元细胞悬液，在37℃5％CO2培养。培养9d后，实验分组为正常对照组：换正常细胞外液处理3h，然后恢复正常培养24h；无Mg2+诱导组、甜菜碱组、γ-氨基丁酸组、丙戊酸钠组分别换成无镁细胞外液或添加相应的100μmol/L甜菜碱、100μmol/L的γ-氨基丁酸、100mg/L的丙戊酸钠混悬液处理3h，然后恢复正常培养，分别在处理后的12h、24h、48h、72h进行MTT检测，观察甜菜碱对大鼠海马神经元癫痫样细胞的保护作用。流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。
1.2.2MTT法检测各组海马神经元细胞存活率取各组待测细胞MTT染色，490nm波长下检测吸光度值。
1.2.3JC-1染色法检测线粒体膜电位培养至第9d的海马神经元，全液更换成无镁细胞外液处理3h之后，实验分组如上，继续培养24h，收集细胞，JC-1染色（按试剂盒要求操作），流式细胞仪检测线粒体膜电位，记录激发波长488nm处红色荧光。
1.3统计学处理采用SPSS18.0的统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2实验结果：2.1MTT检测结果
注：*与正常组比较P<0.01由表所示：模型组细胞凋亡率31.88%较正常组28.84%增高(P<0.01)，而甜菜碱干预后，细胞凋亡率37.43%较正常组显著升高(P<0.01)，表明甜菜碱没有降低癫痫细胞海马神经元的凋亡率。
3讨论癫痫(epilepsy)是一组由大脑神经元异常放电所引起的短暂中枢神经系统功能障碍的一种慢性疾病，具有突然发生、反复发作的特点[1-6]，是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症[2]。
此病发作的不可预知性及反复性，使患者的身心健康受到严重的威胁。一个理想的抗癫痫药物应该在不影响神经元的生理活性下能够防止和抑制病理性神经元的过量放电，癫痫治疗的焦点应该不仅能够抑制癫痫症状的发作，还应该从根本上治疗并治愈该病[1]。
甜菜碱对人体的心血管类、神经类、肝脏类和高半胱氨酸尿症有一定的治疗作用[3]。甜菜碱具有促进脂肪代谢、抗脂肪肝、保护肾脏、降压、缓和应激、增进食欲、稳定维生素等多种药理作用[8]。
王淑秋老师进行的动物实验结果表明甜菜碱可以通过降低大鼠血清中同型半胱氨酸的含量，增加γ-氨基丁酸的含量及其受体的表达，而发挥抗癫痫的作用[3-6]。本实验观察无镁离子诱导的离体培养海马神经元异常放电时线粒体膜电位变化及甜菜碱的干预作用。
目前，氧化应激损伤线粒体参与癫痫病理过程的研究日益受到重视。细胞核决定细胞凋亡，但是随着细胞死亡生物学的研究，人们将更多的关注放在了线粒体上[4],癫痫发作后神经细胞死亡的方式包括坏死和细胞凋亡两种形式[4]。线粒体是细胞进行呼吸作用的细胞器，是细胞能量代谢的中心，通过氧化磷酸化以及ATP的形式为细胞提供能量[7]。线粒体还参与细胞死亡进程的调控，并与衰老、糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、癌症等发病有关。经研究表明，在无镁离子诱导海马神经元模型中，海马神经元凋亡率显著增加，并出现了线粒体超微结构的改变。
本实验通过建立无镁离子海马神经元模型，将海马神经元全液换成无镁细胞液处理3h，然后恢复正常培养6h、24h、48h后取材;将海马神经元全液换成无镁细胞液配制的相应浓度的甜菜碱处理3h，然后恢复正常培养6h、24h、48h后取材。检测各组海马细胞内的细胞凋亡的形态学及进行线粒体膜电位检测。发现模型组细胞线粒体膜电位较正常对照组有明显下降，模型组细胞凋亡率较正常对照组有所上升（P＜0.01），甜菜碱组海马神经元细胞线粒体膜电位与模型组比较下降，甜菜碱组海马神经元细胞凋亡率与模型组比较增加（P＜0.01）。
经研究表明，癫痫神经元细胞存在严重的线粒体功能障碍，线粒体膜电位下降，线粒体出现功能异常，ATP合成减少，从而导致细胞供能不足，最终导致神经元凋亡。本实验与上述结果不一致，无镁离子诱导癫痫海马神经元细胞线粒体膜电位较正常对照组有明显下降，细胞凋亡率较正常对照组有所上升（P＜0.01），甜菜碱组海马神经元细胞线粒体膜电位与模型组比较仍下降，甜菜碱组海马神经元细胞凋亡率与模型组比较仍增加（P＜0.01）。提示在对神经元细胞的保护作用中，甜菜碱活性相对较差，作用微弱。动物实验已证实甜菜碱具有抑制癫痫发作的作用，而本实验结果表明甜菜碱不是通过稳定线粒体膜电位、抑制细胞凋亡的作用机制而抑制癫痫，本实验为深入探讨甜菜碱的药理机制，完善其药用价值提供了一定的临床意义和科研价值。
参考文献：[1]洪钢，章江生，王琳辉．抗癫痫药物研究进展[J]．ChinJClinPharmacolTher2005,10(11):1201-1209.[2]邵帅.杨福义.朴松鹤.齐宇.李军.孙志博.王松禹戊四氮致痫大鼠脑GFAP的变化及甜菜碱的干预作用[期刊论文]-黑龙江医药科学2013(3)99-100[3]ROSENED,SPIEGELMANBM.PPARγ:anuclearregulatorofmetabolism,differentiation,andcellgrowth[J],JBiolChem,2001,276(41):37731-37734.[4]王淑秋李晓捷姜志梅秦晓玉韩玉泽刘蕾刘君星王芳芳梁衍峰王淑湘灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑组织细胞色素C、线粒体钙、HSP70和BDNF的影响中国病理生理杂志201127（6）:1053-1058[5]王辉.王淑湘.崔国利.卢春凤.刘蕾.刘君星.马小茹.王芳芳.梁衍锋甜菜碱对戊四氮致痫大鼠血清中同型半胱氨酸以及对海马γ-氨基丁酸及其受体的影响[期刊论文]-中国微生态学杂志2013(5)528-533[6]王辉.刘蕾.刘君星.马小茹.王芳芳.梁衍锋.吴佳梅.毛金军.王淑秋甜菜碱对戊四氮致痫大鼠海马GABA、Glu影响的研究[期刊论文]-黑龙江医药科学2013(3)1-2[7]孙建英,刘学伍综述,迟兆富线粒体与癫痫[J]中风与神经疾病杂志2005年8月第22卷第4期382-384[8]李炜，张丹参甜菜碱的提取、分离及测定含量方法的研究进展[J];医学综述;2006年第12卷第8期506-507作者简介：通讯作者：刘君星，佳木斯大学基础医学院博士副教授从事脑功能损伤及植物药开发研究资助项目：黑龙江省卫生厅项目资助，项目编号：2012-252